張賀洋，張蕊，王萍萍，王玥，王赫，李艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001）

miR-126 對 HL-60 細(xì)胞系增殖和凋亡等生物學(xué)行為的影響

張賀洋，張蕊，王萍萍，王玥，王赫，李艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001）

目的觀察轉(zhuǎn)染微小 RNA（miR）-126 mimics/inhibitor對人類急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（HL-60）增殖與凋亡的影響。方法培養(yǎng) HL-60 細(xì)胞，RT-PCR 測定 miR-126 相對表達水平，利用瞬時質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor，通過CCK-8，流式細(xì)胞技術(shù)及克隆形成實驗檢測 HL-60 細(xì)胞增殖、凋亡能力。結(jié)果miR-126 mimics組 0 h、24 h、48 h、72 h 細(xì)胞增殖能力顯著減低（P ＜ 0.05）；G1期、S 期、G2期細(xì)胞增殖明顯受抑制（P ＜ 0.05）；晚期凋亡及早期凋亡（UR+LR）凋亡率增高（P ＜0.05）；平均克隆形成率顯著減低（P ＜ 0.05）；miR-126 inhibitor組 0 h、24 h、48 h、72 h 細(xì)胞增殖能力明顯增強（P ＜ 0.05）；G1期、S期、G2期增殖能力增強（P ＜ 0.05）；UR+LR 明顯減低（P ＜ 0.05）；平均克隆形成率顯著升高（P ＜ 0.05）。結(jié)論miR-126 能夠抑制HL-60細(xì)胞增殖能力，促進細(xì)胞凋亡，可能作為抑癌性的微RNA在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

微小RNA-126；急性白血病；增殖；凋亡；急性早幼粒細(xì)胞白血病

微小 RNA（microRNA，miRNA）是從 DNA 轉(zhuǎn)錄而來，在真核生物中廣泛存在的一類長度約為21～23個核苷酸的非編碼核糖核酸分子，通過調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮生物學(xué)作用［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) miRNA 在正常細(xì)胞發(fā)育、腫瘤細(xì)胞形成及造血鏈系分化中發(fā)揮重要作用［2-3］。研究［4-5］表明 在急性髓系白 血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）中存在差異表達。微 RNA（miR）-126 位于 9q34，是內(nèi)皮細(xì)胞特異性 miRNA，參與血管新生、干細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì) 胞 凋 亡 等 多 種生 理 過 程［6-7］。 研 究［6，8］表 明 miR-126可以發(fā)揮癌基因和抑癌基因的雙重作用，它既可促進腫瘤血管新生加速腫瘤發(fā)展，亦可以負(fù)向調(diào)控細(xì)胞傳導(dǎo)通路控制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲。國外研究［8］顯示，miR-126 在核心結(jié)合因子相關(guān)急性髓系 白 血 ?。╟ore binding factor associated acute myeloid leukemia，CBF-AMLs）中高表達，可促進白血病細(xì)胞的增殖、抑制凋亡、發(fā)揮癌基因的作用，但在t（15；17）白血病患者中低表達，其在這類白血病中起何種生物學(xué)作用目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。本研究通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor，上調(diào)/下調(diào) miR-126 的表達，利用細(xì)胞增殖活性 8（cell counting kit-8，CCK-8），流式細(xì)胞技術(shù)及克隆形成實驗，觀察對人類急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（human promyelocytic leukemia cell-60，HL-60）細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HL-60來至中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液研究室；RPMI-1640 購置于 Gibco 公司；miR-126 mimics/inhibitor由上海吉凱公司合成；Attractene Transfection Reagent購置于 QIAGEN 公司；RNase 固相清除劑購置于天恩澤公司；胎牛血清購置于 Hyclone公司；50×TA 購置于海利克思公司；SYBR Green 購置于 Solarbi公司；SuperM-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA 快速提取試劑盒、2×Power Taq PCR、MasterMix購置于 BioTeke 公司；CCK-8 購置于碧云天公司；PBS購置于雙螺公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購置于Wanleibio 公司；甲基纖維素購置于 Adamas-beta 公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購置于萬類生物公司；miR-126引物及U6由萬類生物公司合成。

1.2 HL-60細(xì)胞培養(yǎng)

10%胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)3次傳代，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率＞97%時，用于實驗。半量換液，3 d 傳代1 次。

1.3 實時熒光定量PCR

選擇U6作為內(nèi)參對照，引物序列如下：miR-126上游序列為 5’-CGACGGCATTACTTTTGG-3’，下游序列為 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，U6上游序列為 5’-GTCGTTCGGCAGCACA-3’，下游序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.4 CCK-8 細(xì)胞增殖實驗

培養(yǎng)HL-60細(xì)胞至密度為90%左右。離心后加入 1 mL 的完全培養(yǎng)基。96 孔板，6×103/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 30 min。每孔 10 μL 無血清培養(yǎng)基，0.5 μL轉(zhuǎn)染試劑及 0.12 μg質(zhì)粒，室溫放置 20 min。將混合液加入孔中混勻，37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h。進行CCK-8檢測。

1.5 流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞周期實驗

培養(yǎng)HL-60細(xì)胞至密度為90%左右。離心，加入 1 mL 完全培養(yǎng)基。6 孔板，5×105/孔，100 μL 無血清培養(yǎng)基，1.2 μg 質(zhì)粒及 4.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑。培養(yǎng) 48 h離心收集細(xì)胞，PBS清洗2次，70%乙醇4 ℃固定4 h。PBS 清洗 2 次，加入 100 μL RNase A 重懸，37 ℃避光溫育。500 μL 碘化丙啶染色液，4 ℃避光孵育30 min。隨即進行流式檢測。

1.6 流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞凋亡實驗

培養(yǎng)HL-60細(xì)胞至密度為90%左右，6孔板，5× 105/孔，100 μL 無血清培養(yǎng)基，1.2 μg 質(zhì)粒和 4.5 μL轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng) 48 h。收集細(xì)胞，殘留 50 μL PBS，加入 500 μL Binding Buffer，5 μL Annexin V-FITC，5 mL 碘化丙啶孵育 15 min。隨即進行流式檢測。

1.7 克隆形成實驗

培養(yǎng)HL-60細(xì)胞至密度為90%左右，6孔板，5× 105/孔，100 μL 無血清培養(yǎng)基，1.2 μg 質(zhì)粒、4.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng) 30 min。轉(zhuǎn)染 48 h 后，進行克隆形成實驗。3%甲基纖維素與 RPMI-1640 培養(yǎng)基 1∶1 混合，4 ℃過夜，混勻。每皿接種200個細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3周，進行計數(shù)。

1.8 實驗分組及統(tǒng)計學(xué)分析

HL-60細(xì)胞系，10%胎牛血清培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)3次傳代，臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率＞97%時，用于實驗。隨機分成空白（Control）組、陰性對照（NC）組、miR-126 mimics 組、miR-126 inhibitor組 。 應(yīng) 用 SPSS 17.0 統(tǒng) 計 軟 件 分析，計量資料以x± s表示，計量資料組間比較滿足方差齊性和正態(tài)分布者采用單因素方差分析，不滿足則采用秩和檢驗。計數(shù)資料采用 χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后 HL-60 細(xì)胞系 miR-126 的表達

實時熒光 PCR 技術(shù)測定 HL-60 細(xì)胞系 miR-126相對表達量 2-△△Ct均值為 1.00±0.03；NC 2-△△Ct均值為 1.03 ± 0.03；轉(zhuǎn) 染 miR-126 mimics 后 相 對 表 達 量2-△△Ct均值為 2.51±0.16，miR-126 上調(diào)（P ＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染 miR-126 inhibitor 后 相 對 表 達 量 2-△△Ct均 值 為0.45±0.13，miR-126 下調(diào)（P＜ 0.05）。見圖 1。

2.2 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor后細(xì)胞增殖活性的改變

圖1 轉(zhuǎn)染前后 HL-60 細(xì)胞中 miR-126 的表達Fig.1 miR-126 expression levels in HL-60 cells observed post-transfection

CCK-8 實驗結(jié)果顯示：Control組 0 h、24 h、48 h、72 h OD 均 值 分 別 為 0.309 ± 0.030、0.491 ± 0.046、0.647±0.062、0.734±0.076；NC 組 0 h、24 h、48 h、72 h OD 均 值 分 別 為 0.305 ± 0.034、0.459 ± 0.048、0.597 ± 0.053、0.664±0.664，無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）；miR-126 mimics 組 0、24 h、48 h、72 h OD 均 值 分 別 為 0.308 ± 0.031、0.354 ± 0.043、0.424 ± 0.056、0.537 ± 0.059，細(xì)胞增殖能力顯著減低（P ＜ 0.05）；miR-126 inhibitor組 0、24 h、48 h、72 h OD 均值分別為 0.304± 0.035、0.573±0.051、0.794±0.077、0.894±0.08，細(xì)胞增殖能力顯著增強（P＜ 0.05）。見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor后細(xì)胞周期的改變

圖2 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor后細(xì)胞增殖能力比較Fig.2 Comparison of cell proliferation after transfection with either the miR-126 mimics or inhibitor

流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞周期結(jié)果顯示：Control組 G1期 均 值（48.16 ± 2.50）% ，S 期 均 值（21.35 ± 1.31）%，G2期均值（30.27±1.24）%；NC 組 G1期均值（48.78±2.68）%，S 期均值（22.11±1.21）%，G2期均值（28.12±1.48）%，無統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）；miR-126 mimics組 G1期均值（59.91±2.77）%，S 期均值（16.70± 2.03）%，G2期均值（22.69±0.76）%，細(xì)胞增殖明顯受抑（P ＜ 0.05）；miR-126 inhibitor組 G1期均值（36.68± 2.53）%，S 期均值（25.47±2.32）%，G2期均值（36.36± 0.24）%，細(xì)胞增殖顯著提高（P＜ 0.05）。見圖 3。

2.4 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor細(xì)胞凋亡的變化

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h 流式細(xì)胞計數(shù)測定細(xì)胞凋亡率。Control組 UR（%）+LR（%）為 3.44±0.45；NC 組UR（%）+LR（%）為 4.14± 0.42（P ＞ 0.05）；miR-126 mimics 組 UR（%）+LR（%）為 21.42±2.03，凋亡率明顯增高（P ＜ 0.05）；miR-126 inhibitor 組 UR（%）+LR（%）為 1.93±0.72，凋亡率顯著減低（P ＜ 0.05）。見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染 miR-126mimics/inhibitor 48 h 后細(xì)胞周期變化情況Fig.3 Cell cycle changes 48 hours post-transfection

2.5 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor后細(xì)胞克隆形成的影響

轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h，將細(xì)胞接種于 35 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)，每個平皿 200 個細(xì)胞，3 周觀察克隆。Control組平均克隆形成率（20.17±2.36）%；NC 組平均克隆形成率（19.17±2.25）%，與 Control組相比無明顯變化（P ＞ 0.05）；miR-126 mimics 組 平 均 克 隆形 成 率（9.67±1.26）%，克隆形成率明顯減低（P＜ 0.05）；miR -126inhibitor組平均克隆形成率（32±3.12）%，克隆形成率顯著升高（P＜ 0.05）。見圖 5。

3 討論

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。骨髓中原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖、分化受阻和凋亡受抑，正常造血功能受到嚴(yán)重抑制。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、出血和感染等。同時伴有肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等髓外臟器的浸潤。目前AL病因尚不清楚，可能與環(huán)境因素、電離輻射、化學(xué)毒物接觸相關(guān)。隨著免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)研究的不斷進步，白血病的致病基因及染色體核型異常逐漸被發(fā)現(xiàn)。靶向藥物如全反式維甲酸、格列衛(wèi)的應(yīng)用，使部分AL的預(yù)后得到了明顯改善，甚至治愈。但大部分AL患者目前僅能采取化療治療，總體預(yù)后不佳。

目前研究［9］認(rèn)為 AL 如同其他惡性腫瘤一樣，是多基因突變的結(jié)果。主要的腫瘤事件如染色體重排、缺失、倒位等，但是這不足以單獨導(dǎo)致白血病的發(fā)生，仍然需要第2種或多種基因協(xié)助完成致癌作用［10］。miRNA 是內(nèi)生型，非編碼蛋白 RNAs，通過調(diào)控靶基因，抑制轉(zhuǎn)錄后表達，被認(rèn)為是多種腫瘤如AL、肝癌、肺癌、前列腺癌等的調(diào)控基因［11-12］，miRNA同時也參與造血鏈系分化［3］。值得注意的是，miR-126不僅在造血干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生理過程中起調(diào)控作用，也可能作為癌基因和/或抑癌基因參與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15］。

圖5 轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics/inhibitor后細(xì)胞克隆形成率變化Fig.5 Clonal formation rates after transfection with either a miR-126 mimics or inhibitor

國內(nèi)外關(guān)于 miR-126 作為癌基因在 AL 及實體腫瘤中發(fā)揮作用的研究［9］顯示，miR-126 在不同類型AL 中表達不同，在 AML 患者中 miR-126 高表達，尤其是 CBF-AMLs。體外實驗結(jié)果［16］顯示，過表達 miR-126能夠抑制CBF-AMLs細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞增殖活性，同時小鼠骨髓體外培養(yǎng)上調(diào) miR-126 表達，亦可增強細(xì)胞增殖活性及克隆形成率，尤其是伴有AML1-ETO 突變的白血病細(xì)胞系。然而，同是在CBF-AMLs中關(guān)于 miR-126 的研究卻出現(xiàn)了不一樣的結(jié)果。一般認(rèn)為某一功能基因的缺失或突變，將會導(dǎo)致相反作用的出現(xiàn)。但是研究［17］中發(fā)現(xiàn)抑制miR-126 表達同樣可以促進白血病的發(fā)展。LI等［17］同時也提出 miR-126 高表達患者預(yù)后差，miR-126 低表達對常規(guī)化療藥物敏感。由此可見，miR-126 在CBF-AMLs中作為癌基因發(fā)揮作用還為時尚早。在乳腺癌及肺癌患者中發(fā)現(xiàn)，miR-126 能夠靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子參與血管新生發(fā)揮癌基因作用，體外實驗上調(diào) miR-126 能夠增強腫瘤細(xì)胞增殖及成瘤能力［18-20］。

前期研究及國內(nèi)外研究均有報道［6］，miR-126 在伴有t（15；17）白血病患者中表達減低，不同于CBFAMLs，所以 miR-126 在此類白血病中發(fā)揮何種生物學(xué)作用目前尚不清楚。本研究選取HL-60細(xì)胞系，通過RT-PCR技術(shù)測定miR-126相對表達量，通過瞬時 轉(zhuǎn) 染 技 術(shù) ，轉(zhuǎn) 染 miR-126 mimics/inhibitor，應(yīng) 用CCK-8，流式細(xì)胞技術(shù)及克隆形成技術(shù)，檢測轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞增殖，凋亡等生物學(xué)活性。研究結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染 miR-126 mimics后 HL-60 細(xì)胞增殖活性降低，克隆形成率下降，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞周期出現(xiàn) G1比率增高，增殖受抑。轉(zhuǎn)染 miR-126 inhibbitor后細(xì)胞增殖活性增高，克隆形成率上升，細(xì)胞凋亡率減低。本研究說明在HL-60 細(xì)胞系中，miR-126 可以抑制白血病細(xì)胞的增殖能力，誘導(dǎo)凋亡，可能起到類似抑癌基因的作用。在實體瘤研究［21-25］中發(fā)現(xiàn)，胃癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌、肝癌、骨肉瘤中miR-126表達降低，體外實驗顯示可抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，可能通過靶向調(diào)控 CrK，SOX2，EGFL7，Sirt1 等基因起抑癌基因作用。

miRNA 通過與靶信使核苷酸特異結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達。既然這樣，miRNA 調(diào)控何種靶基因通過何種信號通過參與AL發(fā)生，將成為接下來研究的重點。最近一項研究［17］從 674 種可能為 miR-126 的靶基因進行篩選，最終發(fā)現(xiàn)只有 PLK2 和SPRED1存在明顯相關(guān)，進一步研究證實僅PLK2是miR-126 的靶基因，增強白血病細(xì)胞增殖活性及克隆形成，同時抑制細(xì)胞凋亡。而在 miR-126 低表達白血病中，可能通過誘導(dǎo) FZD7 表達發(fā)揮作用［15］，但能否通過 miR-126 的表達情況，預(yù)測白血病復(fù)發(fā)、預(yù)后及白血病危險分層也需要進一步研究。

本研究較清晰的闡述了 miR-126 能夠抑制 HL-60細(xì)胞系細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞凋亡，起抑癌基因作用。有關(guān) miR-126 在不同白血病亞型發(fā)病中起到何種作用以及 miR-126對于急性髓系白血病診斷及預(yù)后判斷，則需要更多的基礎(chǔ)及臨床實驗進一步證實［26］。相信隨著研究的進一步深入，miR-126 有可能成為治療急性髓系白血病的新靶點。

［1］MEISTER J，SCHMIDT MHH.miR-126 and miR-126*：new players in cancer［J］.Scientific World Journal，2010，10：2090-2100.DOI：10.1100/tsw.2010.198.

［2］MUSIYENKO A，BITKO V，BARIK S.Expression of miR-126*，anintronic product of the vascular endothelial EGF-like 7 gene，regulates prostein translation and invasiveness of prostatecancer LNCaP cells［J］.J Mol Med（Berl），2008，86（3）：313-322.DOI：10.1007/ s00109-007-0296-9.

［3］BAI Y，BAI X，WANG Z，et al.microRNA-126 inhibits ischemia-induced retinal neovascularization via regulating angiogenio growth factors［J］.Exp Mol Pathol，2011，91（1）：471-477.DOI：10.1016/j. yexmp.2011.04.016.

［4］ YANAIHARA N，CAPLEN N，BOWMAN E，et al.Unique micro RNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis［J］. Cancer Cell，2006，9（3）：189-198.DOI：10.1016/j.ccr.2006.01. 025.

［5］FENG R，CHEN X，YU Y，et al.miR-126 functions as a tumour suppressor in human gastric cancer［J］.Cancer Lett，2010，298（1）：50-63.DOI：10.1016/j.canlet.2010.06.004.

［6］CHO WC，CHOW AS，AU JS，et al.Restoration of tumour suppressor hsa-miR-145 inhibits cancer cell growth in lung adenocarcinoma patients withepidermal growth factor receptor mutation ［J］.Eur J Cancer， 2009， 45 （12） ： 2197-2206.DOI： 10.1016/j.ejca.2009.04.039.

［7］SAITO Y，F(xiàn)RIEDMAN JM，CHIHARA Y，et al.Epigenetic therapy upregulates the tumor suppressor microRNA-126 and its host gene EGFL7 inhuman cancer cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，379（3）：726-731.DOI：10.1016/j.bbrc.2008.12.098.

［8］楊東，張紅 .microRNA-126 的生物學(xué)功能［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，12（12）：2773--2777.

［9］LECHMAN ER，GERNTNER B，VAN GP，et al.Attenuation of miR-126 activity expands HSC in vivo without exhaustion［J］.Cell Stem Cell，2012，11（6）：799-811.DOI：10.1016/j.stem.2012.09.001.

［10］PUI CH，JEHA S.New therapeutic strategies for the treatment of acutelymphoblastic leukaemia［J］.Nat Rev Drug Discov，2007，6（2）：149-165.DOI：10.1-38/nrd2240.

［11］BARTEL DP.microRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2002，116（2）：281-297.

［12］WU W，SUN M，ZOU G，et al.microRNA and cancer：current statusand prospective ［J］.Int J Cancer，2007，120：953-960.DOI：10.1002/ijc.22454.

［13］CROCE CM，CALINGA.miRNAs，cancer，and stem cell division［J］.Cell，2005，122（1）：6-7.DOI：10.1016/j.cell.2005.06.036.

［14］ HATA A，KASHIMA R.Dysregulation of microRNA biogenesis machinery in cancer［J］.Crit Rev Biochrm Mol Biol，2016，51（3）：121-134.DOI：10.3109/10409238.2015.1117054.

［15］ TESTA U，PELOSI E.microRNAs expressed in hematopoietic stem/progenitor cells are deregulated in acute myeloid leukemias［J］.Blood，2015，126（17）：2005-2015.DOI：10.3109/10428194. 2014.955019.

［16］LI Z，LU J，SUN M，et al.Distinct microRNA expression profiles in acute myeloid leukemia with common translocations［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（40）：1535-1540.DOI：10.1073/pnas. 0808266105.

［17］LI Z，CHEN P，SU R，et al.Overexpression and knockout of miR-126 both promote leukemogenesi［J］.Blood，2002，126（17）：2005-2015.DOI：10.1182/blood-2015-04-639062.

［18］LIU B，PENG XC，ZHENG XL，et al.miR-126 restoration downregulate VEGFR and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro an in vivo［J］.Lung Cancer，2009，66（2）：169-175.DOI：10.1016/j.lungcan.2009.01.010.

［19］ZHU N，ZHANG D，XIE H，et al.Endotheial-specific intron-derived miR-126 is down-regulated in human breast cancer and targets both VEGFR and PIK3R2［J］.Mol Cell Biochem，2011，351（1/2）：157-164.DOI：10.1007/s11010-011-0723-7.

［20］SASATIRA T，KURIHARA M，BHAWAL UK，et al.Downregulation of miR-126 induces angiogegesis and lymphangiogenesis by activation of VEGFR-A in oral cancer［J］.Br J Cancer，2012，107（4）：700-706.DOI：10.1038/bjc.2012.330.

［21］MIKO E，MARQITAI Z，CZIMMERER Z，et al.miR-126 inhibits proliferation of small cell lung cancer cells by targeting SLC7A5［J］.Febs Lett，2011，585（8）：1191-1196.DOI：10.1016/j.febslet.2011.03.039.

［22］SUN Y，BAI Y，ZHANG F，et al.miR-126 inhibits non-small cell lung cancer cells proliferation by targeting EGFL7［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（3）：1483-1489.DOI：10.1016/j. bbrc.2009.12.098.

［23］CRAMFORD M，BRAWNER E，BATTE K，et al.microRNA-126 inhibits invasion in non-small cell lung carcinoma cell lines［J］. Biochem Biophys Res Commun，2008，373（4）：607-612.DOI：10.1016/j.bbrc.2008.06.090.

［24］YANG C，HOU C，ZHANG H，et al.miR-126 functions as a tumor suppressor in osteosarcoma by targeting SOX2［J］.Int J Mol Sci，2014，15（1）：423-437.DOI：10.3390/ijms15010423.

［25］OTSUBO T，AKIYAMA Y，HASHIMOTO Y，et al.microRNA-126 inhibits SOX2 expression and contributes to gastric carcinogenesis［J］.PloS One，2011，6（1）：16617-16620.DOI：10.1371/journal. pone.0016617.

［26］LECHMAN ER，GENTNER B，VAN G，et al.Attenuation of miR-126 activity expands HSC in vivo without exhaustion ［J］.Cell Stem Cell，2012，11（6）：799-811.DOI：10.1016/j.stem.2012.09. 001.

（編輯 北 辰）

Role of miR-126 in the Biological Behavior of HL-60 Cell Line

ZHANG Heyang，ZHANG Rui，WANG Pingping，WANG Yue，WANG He，LI Yan

（Department of Hematology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo cultivate human leukemia cells（HL-60）which were transiently transfected either a miR-126 mimic or inhibitor，and then to characterize the proliferation and apoptotic behavior of the transfected leukemia cells.MethodsThe leukemia cell line was developed and RT-PCR was performed to evaluate miR-126 expression levels.An instantaneous plasmid transfection technique was used to transfect cells with either the miR-126 mimic or inhibitor.CCK-8，F(xiàn)CM，and clone formation tests were performed to analyze the proliferative and apoptotic behaviors of the leukemia cells.ResultsProliferation was significantly decreased in cells transfected with the miR-126 mimic for 0，24，48，and 72 hours（P ＜ 0.05）.Specifically，the G1，S，and G2phases were significantly inhibited（P ＜ 0.05），the late and early apoptosis（UR+LR）rate increased（P ＜ 0.05），and the average rate of colony formation was also significantly decreased（P ＜ 0.05）.Additionally，proliferation was significantly increased in cells transfected with the miR-126 inhibitor for 0，24，48，and 72 hours（P ＜ 0.05）.Specifically，the G1，S，and G2phases were increased（P ＜ 0.05），the UR+LR decreased significantly（P ＜ 0.05），and the average rate of colony formation was significantly increased（P ＜0.05）.ConclusionIn HL-60 cells，miR-126 can inhibit proliferation and promote apoptosis；thus，miR-126 may play an important role in the occurrence and development of leukemia as a tumor-suppressor miRNA.

miR-126；leukemia；proliferation；apoptosis；acute promyelocytic leukemia

R318.12

A

0258-4646（2017）09-0796-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1318.014.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.007

遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（201302103）

張賀洋（1986-），男，主治醫(yī)師，碩士.

李艷，E-mail：liyan2@medmail.com.cn

2016-12-29

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-09-06 13:18