徐紅，張成鴻，關欣，董浩，徐榮謙，陳雨，高萌，田燕

（大連醫(yī)科大學 1. 基礎醫(yī)學院機能學實驗室；2. 藥學院藥劑學教研室；3. 八年制2016級臨床醫(yī)學專業(yè)，遼寧 大連 116044）

槲皮素PLGA-TPGS納米粒對小鼠肝癌異位實體瘤治療效果的研究

徐紅1，張成鴻1，關欣2，董浩2，徐榮謙3，陳雨3，高萌2，田燕2

（大連醫(yī)科大學 1. 基礎醫(yī)學院機能學實驗室；2. 藥學院藥劑學教研室；3. 八年制2016級臨床醫(yī)學專業(yè)，遼寧 大連 116044）

目的考察槲皮素 PLGA-TPGS 納米粒（QPTN）在體內(nèi)對荷腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細胞 HCa-F 小鼠異位移植實體瘤的治療效果。方法建立荷 HCa-F 肝癌細胞小鼠模型后，隨機分為陰性對照組、空白納米粒組、5-氟尿嘧啶溶液（FS）組、槲皮素溶液（QTS）組、槲皮素 PLGA 納米粒（QPN）組和 QPTN 組。尾靜脈給藥，每 2 d 1 次，連續(xù)給藥 20 d 后處死小鼠，剝離腫瘤，稱質(zhì)量，測量腫瘤體積，根據(jù)公式計算腫瘤體積增長量和抑瘤率；行HE染色觀察腫瘤，全面評價QPTN對荷瘤小鼠的治療效果。結果小鼠體內(nèi)給藥 10 次后，QPTN 組、QPN 組、FS 組的腫瘤體積增長量與陰性對照組相比明顯減小（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01），QPTN 組抑瘤率（59.07%）明顯高于 QTS 組（23.94%）、FS 組（35.14%）和 QPN 組（46.14%）。HE 染色結果也顯示 QPTN 組對小鼠腫瘤的治療效果最明顯。結論與QPN、QTS和FS相比，QPTN對荷HCa-F肝癌細胞小鼠異位實體瘤具有較好的治療效果。

槲皮素；納米粒；小鼠；腫瘤；HCa-F肝癌細胞；抑瘤率

肝癌是最常見的、死亡率較高的惡性腫瘤之一［1］。采用納米粒（nanoparticles，NPs）等靶向給藥系統(tǒng)不僅可增加藥物對腫瘤組織的靶向性，減少用藥量，從而降低對正常細胞的毒性，還可改變藥物的體內(nèi)溶解性和體外穩(wěn)定性，提高其在靶部位的生物利用度，是目前常見的肝癌治療手段之一［2］。槲皮素（Quercetin，QT）主要分布在槐花、丹皮、菊花等多種植物的花、葉、果實中，來源非常廣泛，具有抗炎、抗病毒、抗肝癌等多種藥理作用［3-7］。本研究擬建立荷腹水型肝癌高淋巴道轉(zhuǎn)移細胞HCa-F小鼠異位移植腫瘤模型［8］，采用自制材料乳酸羥基乙酸共聚物-維生素 E 聚乙二醇 1000 琥珀酸酯（polylacticco-glycolic acid tocopherol polyethylene glycol 1000 succinat，PLGA-TPGS）為載體，制備 QT 納米粒（QT-loaded PLGA-TPGS NPs，QPTN），并 以 市 售 材 料PLGA 為 載 體 制 備 的 QT PLGA 納 米 粒（QT-loaded PLGA NPs，QPN）作對照，通過計算給藥后腫瘤體積增長量、抑瘤率（tumor inhibition rate，TIR）、瘤內(nèi) QT含量和觀察腫瘤切片蘇木素和曙紅（HE）染色，定量、定性地全面考察QPTN對小鼠體內(nèi)異位實體瘤的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：QT 對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號 100081-200907，純度 99%）；QT（美侖生物公司，批號 20140105，純度 96%）；QPTN（藥劑學教研室自制，批號 20140910，QT：215 mg/g）；QPN（藥劑學教研室自制，批號 20140910，QT：150 mg/g）；5-氟尿嘧啶注射液（25 mg/mL，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號1402181）；香蘭素（分析純，北京化學試劑公司，批號010901，純度99%）。

1.1.2 細胞株：小鼠腹水型高淋巴道轉(zhuǎn)移 HCa-F 細胞株由大連醫(yī)科大學形態(tài)學實驗室提供。

1.1.3 實驗動物：健康 8 周齡昆明種小鼠（SPF 級），體質(zhì)量 20～25 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號 SCXK（遼）2008-0002。

1.2 方法

1.2.1 瘤內(nèi)測定 QT 的色譜條件：色譜柱為 Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長為 360 nm；流速為 0.8 mL/min；流動相為乙腈∶0.3%磷酸水溶液（33∶67）；柱溫為 30 ℃；進樣量為 20 μL。

1.2.2 動物分組及給藥方案：參考文獻［8］建立荷HCa-F細胞小鼠肝癌異位實體瘤模型，將實體瘤長徑（12～15 mm）符合要求的小鼠隨機分為陰性對照組、空白納米粒（EPTN）組、5-氟尿嘧啶溶液（5-fluorouracil solutions，F(xiàn)S）組、槲皮素溶液（QTS）組、QPN組和QPTN組，每組8只，采用尾靜脈給藥方式，每2 d 給藥 1 次，持續(xù)給藥 20 d。陰性對照組注射含 20% PEG40 的 生理鹽水溶液 0.2 mL；EPTN 組注射不 含QT的空白納米粒，材料及濃度與QPTN相同；FS組注射 FS（取 25 mg/mL 的 5-氟尿嘧啶溶液 1 mL 置 10 mL量瓶中，加入含20%PEG400的生理鹽水溶液定容 至 刻 度）10 mg/kg；QTS 組 注射 QTS（取 QT 12.50 mg置 10 mL 量瓶中，加入含 20%PEG400 的生理鹽水溶液溶解、定容至刻度）10 mg/kg；QPN 組、QPTN組 分 別 注 射 相 當 于 10 mg/kg QT 的 QPN 混 懸 液 或QPTN 混懸液（取 QPN 82.78 mg 或 QPTN 57.87 mg置10 mL量瓶中，加入含20%PEG400的生理鹽水溶液分散、定容至刻度，注射前在100 W超聲條件下超聲1 min 后備用）。

1.2.3 檢測指標：

1.2.3.1 腫瘤體積增長量 在給藥前后，用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑及短徑，計算腫瘤體積［體積=長徑×（短徑）2/2］和實體瘤體積增長量（實體瘤體積增長量=給藥后實體瘤體積-給藥前實體瘤體積）。

1.2.3.2 小鼠體質(zhì)量監(jiān)測 給藥期間在每次給藥前測定每只小鼠的體質(zhì)量，按照實際體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，并記錄各組小鼠體質(zhì)量變化。

1.2.3.3 TIR 在停藥次日，頸椎脫位法處死小鼠，小心剝離瘤體，稱質(zhì)量。計算 TIR（%）=（陰性對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/陰性對照組平均瘤質(zhì)量×100。

1.2.3.4 瘤內(nèi) QT 含量的測定 （1）QT 和香蘭素對照貯備液的配制。取干燥至恒重的 QT 對照品 5.0 mg，用甲醇溶解、定容至 50 mL，配成濃度為 100 μg/mL的 QT 對照貯備液。取香蘭素對照品 25.0 mg，加甲醇溶解、定容至 10 mL，配成濃度為 2.5 mg/mL 的內(nèi)標對照貯備液，4 ℃貯存?zhèn)溆?。?）QT 系列濃度對照溶液的配制。取 QT 對照貯備液 5、10、20、40、80、160、320 μL 于 10 mL 量瓶中，分別加入香蘭素內(nèi)標對照貯備液 100 μL，加甲醇定容至刻度，配成濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μg/mL 的 QT 系列對照溶液（含香蘭素 25.0 μg/mL），4 ℃貯存?zhèn)溆?。?）QT標準曲線的繪制。隨機選取陰性對照組的2只小鼠，剖取實體瘤后稱質(zhì)量，加入4倍量的生理鹽水后研磨成勻漿。量取實體瘤勻漿 400 μL 7 份，分別置 5 mL 離心管中，每份分別加入 QT 系列濃度對照溶液 100 μL，渦旋 1 min 混合均勻，加入乙酸乙酯 2 mL 萃取，渦旋混合 1 min，10 000 r/min 離心 10 min。分離出有機層并用氮氣流吹干，殘留物加入甲醇0.2 mL 復溶，渦旋 1 min 后，按 1.2.1 色譜條件測定。（4）瘤內(nèi) QT 含量的測定。隨機選取 QTS、QPN、QPTN組中的6只小鼠，剖取實體瘤，稱質(zhì)量，加入4倍量的生理鹽水后研磨成勻漿，按照 1.2.1 色譜條件測定QT與內(nèi)標峰面積，再計算QT含量。

1.2.3.5 標本采集與 HE 染色處理 隨機選取 2 個稱質(zhì)量后的腫瘤，切取適宜部位的組織并將其及時固定在 10%中性甲醛緩沖液中，固定 24 h，沖洗、脫水透明、浸蠟、包埋并制石蠟切片，行HE染色，觀察腫瘤組織形態(tài)學的改變。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用x± s表示，采用方差分析比較多組資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瘤內(nèi)測定QT的色譜條件

在 1.2.1 色譜條件下，QT 與其他各組分峰和內(nèi)標物香蘭素（1.0 μg/mL）色譜峰能達到基線分離，空白小鼠腫瘤勻漿對樣品的測定均無干擾，保留時間分別為 7.2 min、5.1 min，理論板數(shù)按 QT 峰計算不低于 3 000，其腫瘤勻漿的色譜圖見圖1。以QT 與香蘭素峰面積（A）的比值對濃度C進行線性回歸，得到腫瘤勻漿中 QT 的標準曲線方程為 A=0.058 4C+ 0.008，r=0.9991。結果表明，QT 在腫瘤勻漿中 0.5～32.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。以信噪比為 3 和10作為QT的檢測限與定量限，測得二者分別為 0.3 μg/mL 與 0.5 μg/mL，方法學考察結果均符合相關規(guī)定。

圖1 QT的反相高效液相色譜圖Fig.1 RP-HPLC images of QT

2.2 小鼠體質(zhì)量的監(jiān)測

給藥期間各組小鼠的體質(zhì)量均有一定程度的增長（圖2），其中，陰性對照組和EPTN 組小鼠增長較明顯；QPTN組小鼠的體質(zhì)量改變相對較小，但與陰性對照組和EPTN組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各 組 之 間 比 較 ，差 異 無 統(tǒng) 計 學 意 義（P ＞ 0.05）。

圖2 荷瘤小鼠給藥期間體質(zhì)量變化（n=8）Fig.2 The average body weight of the mice in each group during the administration period（n=8）

2.3 腫瘤體積增長量和TIR 的測定結果

給藥前后小鼠腫瘤體積增長量和TIR測定結果見表1。結果表明，給藥后，F(xiàn)S組、QPN組、QPTN組的腫瘤體積增長量與陰性對照組相比具有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），說明這 3 組均能在不同程度上抑制腫瘤的生長，QTS組也有一定程度的減小，但與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，而EPTN組沒有明顯效果。與QTS組相比，QPTN組、QPN組抑制腫瘤生長的效果更為明顯，小鼠腫瘤體積增長量分別降低了 1.57、0.93 cm3，但差異無統(tǒng)計學意義；TIR 分別增加了 35.13%、22.14%，且 QPTN 效果更顯著，TIR較 QPN 組增加了 12.93%，腫瘤體積增長量減少了0.64 cm3。與 FS 組相比，QPTN 組、QPN 組對腫瘤的抑制作用也相對更明顯，2組小鼠腫瘤體積增長量比 FS 組分別降低了 1.48、0.84 cm3，但差異無統(tǒng)計學意義，TIR 分別增加了 23.93%、11.00%，表明自制納米粒組比市售的5-氟尿嘧啶注射液對荷瘤小鼠腫瘤的生長具有更好的抑制效果。

2.4 腫瘤內(nèi)QT含量的測定

表1 給藥前后腫瘤體積增長情況、抑瘤率及瘤內(nèi)QT含量Tab.1 Tumor volumes，tumor inhibition rates，and QT content in each group（

表1 給藥前后腫瘤體積增長情況、抑瘤率及瘤內(nèi)QT含量Tab.1 Tumor volumes，tumor inhibition rates，and QT content in each group（

1）P ＜ 0.05，2）P ＜ 0.01 vs the negative control group and EPTN group，respectively；3）P ＜ 0.05 vs corresponding QTS group；4）P ＜ 0.05，5）P ＜ 0.01 vs corresponding QTS group，respectively.TIR，tumor inhibition rate.

Group Volume of tumor（cm3，n=8） Tumer weight TIR Content of QT in tumor（n=6）Before administration After administration Volume growth （g，n=8） （%） （μg） （μg/g）Negative control 0.38±0.07 6.40±1.39 6.02±1.45 5.18±1.12 - - -EPTN 0.41±0.08 6.19±1.32 5.78±1.16 5.05±1.07 2.51 - -FS 0.43±0.09 3.68±1.16 3.25±0.511） 3.36±0.651） 35.14 - -QTS 0.42±0.08 3.76±1.05 3.34±0.74 3.94±0.58 23.94 3.26± 0.24 0.83± 0.05 QPN 0.41±0.06 2.82±0.91 2.41±0.471） 2.79±0.521） 46.14 20.18±0.935） 7.23±0.684）QPTN 0.44±0.08 1.21±0.52 1.77±0.321），3） 2.12±0.282），3） 59.07 28.41±1.375） 13.40±1.095）

采用 RP-HPLC 法測定 QTS、QPN和 QPTN 組小鼠給藥后腫瘤內(nèi)的QT含量，結果見表1。可見2個納米粒組瘤內(nèi)QT含量均比QTS組高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05 或P ＜ 0.01）。

2.5 HE染色

圖3 代表性的HCa-F細胞肝癌實體瘤組織切片 HE ×400Fig.3 Representative images of HCa-F hepatocarcinoma solid tumors HE×400

將稱質(zhì)量后的腫瘤切片行HE染色、鏡檢，典型圖片結果見圖3。陰性對照組（圖3A）腫瘤細胞形態(tài)完整，生長旺盛、漿少核大，多為單核或多核，位于細胞中央位置。EPTN組（圖3B）與陰性對照組無明顯差異，細胞數(shù)量多、排列紊亂、密集成團。FS組（圖3C）腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)大面積的壞死區(qū)域，細胞核的顏色逐漸變淺。與QTS組（圖3D）相比，QPTN組（圖3F）有更多的破碎和結構不完整的細胞出現(xiàn)，邊緣形態(tài)較為模糊，而QPN組（圖3E）介于二者之間，可見納米粒較QT溶液抑制腫瘤的效果更加顯著。結果表明，無論從腫瘤體積增長量、TIR定量方面，還是從病理學切片定性方面，QPTN對腫瘤的治療效果最好，其次是QPN，且納米粒載體材料PLGATPGS對腫瘤生長無明顯的抑制作用（圖3B）。

3 討論

本研究組在預實驗中曾采用 1 次/d 的給藥頻率，結果FS組小鼠在第4天出現(xiàn)死亡，其他組小鼠（尤其 QTS 組）精神狀態(tài)不佳，故改為每 2 d 1 次尾靜脈給藥，連續(xù)給藥20 d。同時，延長給藥間隔使納米?？梢愿油耆匕l(fā)揮其緩釋作用，從而達到更好的治療效果。

本研究結果顯示，與其他組相比，QPTN對荷HCa-F細胞小鼠肝癌異位實體瘤具有良好的治療效果。分析其原因是由于QPTN粒徑較小、表面帶負電荷（絕對值較大），具有較好的被動靶向性，并且PLGA-TPGS是兩親性載體材料，本研究前期采用超聲乳化—溶劑揮發(fā)法制備的QPTN屬于納米球型納米粒，模型藥物QT可以分子或無定型粉末狀態(tài)高度分散在載體材料中，材料在體液或細胞質(zhì)中溶解較慢，故有很好的緩釋作用；同時，由于TPGS具有一定的水溶性，材料在體內(nèi)可以逐漸溶解和降解，故可將藥物更完全地釋放出來、更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用［9-11］。與 QTS 組和 FS 組比較，QPTN 和 QPN 這 2種納米粒對腫瘤都發(fā)揮了較好的治療效果，這是因為納米粒在體內(nèi)能緩慢而持續(xù)地釋放藥物，能被腫瘤細胞更好地攝取，對腫瘤組織具有良好的靶向作用［9-11］，而 QTS 和 FS 靜脈注射給藥后沒有選擇性和緩釋性，故治療效果不如納米粒組。在2種納米粒中，QPTN對腫瘤生長的抑制作用比QPN好，這是由于與QPN相比，QPTN具有更小的粒徑，更高的載藥量，可以被腫瘤細胞攝取的更多，進入細胞內(nèi)的QT量也更大，同時，制備QPTN的自制載體上所連接的TPGS不僅可降低腫瘤細胞內(nèi)P-糖蛋白介導的多藥耐藥性，減少 QT 從細胞中外排［12］，加強 QT 的吸收，還由于TPGS具有良好的親水性，可以使QT在細胞內(nèi)釋放、溶解的更多，從而更好地發(fā)揮對腫瘤的治療作用。

［1］EL-SERAG HB.Hepatocellular carcinoma：an epidemiologic view［J］.J Clin Gastroenterol，2002，35（Suppl 2）：S72-S78.

［2］MEHTA RG，MURILLO G，NAITHANI R，et al.Cancer chemoprevention by natural products：how far have we come? ［J］.Pharm Res，2010，27（6）：950-961.DOI：10.1007/s11095-010-0085-y.

［3］張志琴，朱雙雪 .槲皮素的藥理活性與臨床應用研究進展［J］.藥學研究，2013，32（7）：400-403.

［4］DAJAS F.Life or death：neuroprotective and anticancer effects of quercetin［J］.J Ethnopharmacol，2012，143（2）：383-396.DOI：10.1016/j.jep.2012.07.005.

［5］趙旭林，徐國昌，賀利民，等.槲皮素誘導人肝癌 HepG2細胞凋亡的實驗研究［J］.實用心腦肺血管病雜志，2010，18（3）：310-311.

［6］ TAN J，WANG B，ZHU L.Regulation of survivin and Bcl-2 in HepG2 cell apoptosis induced by quercetin［J］.Chem Biodivers，2009，6（7）：1101-1110.DOI：10.1002/cbdv.200800141.

［7］舒毅，譚陶，張思宇，等 .槲皮素的藥理學研究進展［J］.華西藥學雜志，2008，23（6）：689-691.

［8］GAO M，XU H，ZHANG CH，et al.Preparation and characterization of curcumin thermosensitive hydrogels for intratumoral injection treatment［J］.Drug Dev Ind Pharm，2014，40（11）：1557-1564. DOI：10.3109/03639045.2013.838579.

［9］顧曉華，秋澤文，徐紅，等 .齊墩果酸/PLGA-TPGS 納米粒在小鼠體內(nèi)的分布及肝靶向性研究［J］.中國藥房，2012，23（33）：3086-3089.DOI：10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.06.

［10］BAO X，GAO M，XU H，et al.A novel oleanolic acid-loaded PLGATPGS nanoparticle for liver cancer treatment［J］.Drug Dev Ind Pharm，2015，41（7）：1193-1203.DOI：10.3109/03639045.2014. 938081.

［11］LIU H，GAO M，XU H，et al.A promising Emodin-loaded poly（lactic-co-glycolic acid）-d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate nanoparticles for liver cancer therapy［J］.Pharm Res，2016，33（1）：217-236.DOI：10.1007/s11095-015-1781-4.

［12］GUO Y，LUO J，TAN S，et al.The applications of vitamin E TPGS in drug delivery［J］.Eur J Pharm Sci，2013，49（2）：175-186. DOI：10.1016/j.ejps.2013.02.006.

（編輯 王又冬）

The Therapeutic Effect of Quercetin-loaded PLGA-TPGS Nanoparticles on the Hepatocarcinoma Ectopic Solid Tumor-bearing Mice

XU Hong1，ZHANG Chenghong1，GUAN Xin2，DONG Hao2，XU Rongqian3，CHEN Yu3，GAO Meng2，TIAN Yan2

（1.Laboratory of Medical Function，College of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；2.Department of Pharmaceutics，College of Pharmacy，Dalian Medical University，Dalian 116044，China；3.Students at Grade 2016 in Clinical Medical Eight Grade，Dalian Medical University，Dalian 116044，China）

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of Quercetin（QT）-loaded PLGA-TPGS nanoparticles（QPTN）on solid tumor-bearing mice with HCa-F hepatocarcinoma in vivo.MethodsThe model of HCa-F hepatocarcinoma solid tumor-bearing mice was established by implanting HCa-F cells into 48 mice.The mice were divided into 6 groups randomly：the negative control，empty PLGA-TPGS nanoparticles，5-Fluorouracil solutions（FS），Quercetin solutions（QTS），QT-loaded PLGA nanoparticles（QPN），and QPTN groups.Each group was treated using tail vein twice a day for 20 days；then，all mice were sacrificed.The increment tumor volumes and tumor growth inhibition rate were counted.Then，tumor specimens were prepared for hematoxylin&eosin（HE）staining and observed under a microscope.ResultsThe results showed that the increment tumor volumes of mice in the QPTN，QPN，and FS groups were significantly smaller than that in the negative control group（P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01）.The tumor growth inhibition rate of the QPTN group was 59.07%，which was much higher than that of the QTS group（23.94%），the FS group（35.14%），and the QPN group（46.14%）.The results of the HE staining on the tumor sections also indicated that the QPTN group showed a better therapeutic outcome compared to the other groups.ConclusionThe QPTN has a better therapeutic effect on the model of solid tumor using HCa-F cells-bearing mice than the QPN，QTS，and FS.

Quercetin；nanoparticles；mice；tumor；HCa-F hepatocarcinoma cells；tumor growth inhibition rate

R944.9

A

0258-4646（2017）09-0791-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1318.010.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.006

遼寧省自然科學基金（2015020308）

徐紅（1970-），女，實驗師，本科.

田燕，E-mail：tiany2004@126.com

2016-12-08

網(wǎng)絡出版時間：2017-09-06 13:18