張忠霞，馬曉偉，王彥永，邱會卿，王銘維

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省腦老化與認知神經(jīng)科學實驗室，石家莊 050031）

雷帕霉素對老齡帕金森病模型小鼠線粒體損傷的改善作用

張忠霞，馬曉偉，王彥永，邱會卿，王銘維

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省腦老化與認知神經(jīng)科學實驗室，石家莊 050031）

目的探討雷帕霉素（RAPA）對老齡帕金森病（PD）模型小鼠線粒體損傷的改善作用。方法選用12月齡快速老化小鼠P8 系（SAMP8）40只，隨機分為空白組、模型組、RAPA低劑量組、中劑量組和高劑量組。對模型組、RAPA低、中、高劑量組小鼠皮下注射 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）制成 PD 模型小鼠。RAPA 低、中、高劑量組從制模前 7 d、制模過程中 5 d、制模后 7 d 分別按 1、2、4 mg·kg-1·d-1持續(xù)給予 RAPA；空白組、模型組同法注射等體積無菌生理鹽水。給藥結束后對各組小鼠進行行為學檢測及黑質(zhì)多巴胺（DA）含量檢測，分析各組小鼠線粒體跨膜電位及線粒體復合物活性的差異。結果與空白組小鼠相比，模型組小鼠的行為學成績、黑質(zhì) DA 含量、線粒體跨膜電位和復合物Ⅰ活性均顯著下降（P ＜ 0.05）；與模型組小鼠相比，RAPA 不同劑量組小鼠的上述指標均顯著改善（P＜ 0.05）；不同劑量 RAPA 組之間無統(tǒng)計學差異。結論RAPA 對老齡 PD 模型小鼠具有保護作用，其機制可能與保護其線粒體損傷有關。

雷帕霉素；老齡；帕金森??；線粒體

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是多因素介導的中老年退行性疾病。衰老因素可與毒素、遺傳等協(xié)同加速 PD 的發(fā)生和發(fā)展［1］，衰老對 PD 病理改變中線粒體的影響已成為目前的研究熱點之一［2］。研究［3］顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路參與細胞衰老、機體老化和年齡相關的疾病。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）對 PD 的改善作用也已有報道［4］，多認為與抑制老化過程中的自噬有關。本研究擬選用快速 老 化 小 鼠 P8 系（senescence-accelerated prone mouse 8，SAMP8），使用經(jīng)典神經(jīng)毒素 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetra-hydropyridine，MPTP）制備 PD 模型，從抑制老化過程中線粒體損傷的角度探討RAPA對PD的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

清潔級、健康、雌性、12月齡SAMP8小鼠40只，體質(zhì)量（30±2）g，由香港中文大學解剖學系惠贈。自由飲食水，12 h 晝夜，室溫（22±2）℃飼養(yǎng)。

RAPA購自美國Sigma公司，線粒體復合物試劑盒購自美國 GENMED 公司；流式細胞儀（FACSCalibur）購自美國 BD 公司，熒光染色劑購于美國 Bio Vision公司。

1.2 方法

1.2.1 PD 模 型 制 備 與 給 藥 ：按 隨 機 數(shù) 字 表 法 將SAMP8小鼠隨機分為空白組、模型組、RAPA低劑量組、RAPA 中劑量組和 RAPA 高劑量組，每組各 8只。對模型組、RAPA不同劑量組的小鼠皮下注射MPTP 制 備 亞 急 性 PD 模 型 ，連 續(xù) 注 射 5 d，27 mg·kg-1·d-1；RAPA 低、中、高劑量組分別按 1、2 和 4 mg·kg-1·d-1劑量，在 PD 模型制備前 7 d、制模過程中5 d 和制模后 7 d 每天持續(xù)給予 RAPA 溶液灌胃。對RAPA粉劑使用蓖麻油進行溶解。空白組與模型組小鼠同法灌注等體積蓖麻油。

1.2.2 行為學測試及黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）含量水平檢測：給藥結束后，對各組老齡SAMP8小鼠進行滾軸實驗檢測其運動功能。滾軸活動儀購自意 大 利 Ugo Basile 公 司（型 號 為 47650 Rota-Rod）。正式測試之前令小鼠在活動儀上適應 2 min，之后開始正式測試。轉(zhuǎn)速為 20 r/min，記錄 3 min 內(nèi)小鼠從滾軸上掉落的次數(shù)，并記錄從測試開始至第1次掉落的時間，視為掉落潛伏期。行為學測試后各組取3只小鼠快速斷頭處死，冰上分離中腦部分，液氮冷凍，高效液相—電化學法測定DA含量。

1.2.3 線粒體跨膜電位及線粒體復合物Ⅰ活性的檢測：行為學實驗完成后，冰上分離各組老齡SAMP8小鼠中腦黑質(zhì)部分，使用線粒體分離試劑盒進行線粒體的分離和提取。按試劑盒說明書步驟操作。使用流式細胞儀檢測線粒體膜電位。選用FL-1 和FL-2通道，加入 JC-1 熒光試劑及線粒體，對捕獲的綠色和紅色熒光信號進行分析。綠色熒光值代表單體含量，紅色熒光值代表聚合體，紅綠熒光值的比值代表膜電位的高低，數(shù)值越小，膜電位越小。采用分光光度法檢測各組老齡SAMP8小鼠線粒體復合物Ⅰ的活性，以每分鐘每毫克蛋白中消耗的煙 酰 胺腺 嘌 呤二核 苷 酸（nicotinamideadenine dinucleotid，NADH）的檢測值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。各組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠滾軸實驗結果

與空白組比較，模型組小鼠在滾軸上運動的掉落潛伏期顯著縮短，掉落次數(shù)明顯增加（P＜ 0.05）；而與模型組相比，不同劑量RAPA組小鼠掉落潛伏期延長，掉落次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；RAPA 低、中、高劑量組之間無統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組小鼠滾軸實驗成績Tab.1 Rolling test performance on mice in every group（x±s）

表1 各組小鼠滾軸實驗成績Tab.1 Rolling test performance on mice in every group（x±s）

1）P ＜ 0.01 vs blank group；2）P ＜ 0.05 vs model group；3）P ＜ 0.01 vs model group.

Group n Fall latency（s） Drop times（n）Blank 8 22.5±6.3 17.5±5.3 Model 8 10.7±5.01） 29.3±7.41）RAPA low-dose 8 17.2±2.12） 21.4±3.72）RAPA middle-dose 8 16.8±3.52） 20.3±3.52）RAPA high-dose 8 15.3±2.42） 21.8±4.13）

2.2 各組小鼠黑質(zhì)DA含量

與空白組小鼠黑質(zhì) DA 含量［（632.33±89.21）nmol/L］比較，模型組小鼠黑質(zhì) DA 含量［（107.52± 28.15）nmol/L］下降 83.0%（P ＜ 0.05）；與模型組比較，RAPA 低、中、高劑量組黑質(zhì) DA 含量［（433.26± 76.10） nmol/L，（478.21 ± 80.91） nmol/L，（482.26 ± 66.43）nmol/L］均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；RAPA 不同劑量組之間無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。

2.3 各組小鼠黑質(zhì)線粒體膜電位及線粒體復合物Ⅰ活性

與空白組相比，模型組小鼠黑質(zhì)線粒體膜電位、線粒體復合物Ⅰ活性顯著下降（P＜ 0.05）；與模型組相比，各劑量RAPA組小鼠的上述指標顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）；而各劑量 RAPA組之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）。 見表 2。

表2 各組小鼠黑質(zhì)線粒體膜電位、線粒體復合物Ⅰ活性Tab.2 Mitochondrial membrane potential and mitochondrial complex I activity in the substantia nigra of mice in each group（x±s）

表2 各組小鼠黑質(zhì)線粒體膜電位、線粒體復合物Ⅰ活性Tab.2 Mitochondrial membrane potential and mitochondrial complex I activity in the substantia nigra of mice in each group（x±s）

1）P ＜ 0.01 vs blank group；2）P ＜ 0.05 vs model group；3）P ＜ 0.01 vs model group.

Group Mitochondrial membrane potential（%） Mitochondrial complex I（μmol·mg-1·min-1）Blank 91.23±15.22 25.35±4.36 Model 17.25±5.081） 12.38±2.841）RAPA low-dose 59.93±20.713） 18.11±5.702）RAPA middle-dose 65.21±18.363） 19.95±6.142）RAPA high-dose 63.37±19.253） 18.94±5.762）

3 討論

衰老因素的PD致病性越來越受到重視，它與環(huán)境毒素、遺傳因素等共同作用，導致氧化應激、免疫炎癥等改變，加速 PD 的發(fā)生和發(fā)展［5-7］。而 PD 線粒體的生物學改變及其功能障礙也是目前被關注的熱點。一方面，線粒體產(chǎn)生ATP，供給DA能神經(jīng)元所需能量，保證 DA 的足量釋放［8］；另一方面，線粒體內(nèi)存在部分α突觸核蛋白，可以選擇性地與線粒體膜相互作用［9］。線粒體結構功能異常時，α 突觸核蛋白過表達，導致神經(jīng)遞質(zhì)和紋狀體 DA 釋放減少［10］。 本 研 究 結 果 顯 示 ，在 MPTP 作 用 于 老 齡SAMP8小鼠所致的亞急性PD模型中，其運動功能和黑質(zhì)DA含量比正常老齡小鼠顯著降低，線粒體復合物Ⅰ活性和線粒體膜電位顯著下降。

RAPA作為一種傳統(tǒng)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，不僅可以作為免疫抑制劑應用于器官移植，還可用于治療心血管疾病，防止血管再狹窄［11］；目前，越來越多的研究表明，RAPA對于年齡相關的神經(jīng)退行性疾病模型具有治療作用，表現(xiàn)出很強的抗老化效果。本課題 組 的 前期研究［12］發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)的老 齡SAMP8 系原代神經(jīng)元中加入 RAPA，可有效抑制mTOR通路活性，降低神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白磷酸化的水平，從而有效保護海馬區(qū)神經(jīng)元。MALAGELADA等［13］將 RAPA 作用于 PD 的體內(nèi)和體外模型，通過抑制影響神經(jīng)元存活、mTORC1依賴的細胞前體凋亡蛋白 RTP801/REDD1/Ddit4 的翻譯，抑制 Akt激酶的脫磷酸化，阻止了神經(jīng)元的死亡。DEHAY 等［14］亦認為RAPA通過恢復PD體內(nèi)、外模型中溶酶體的病理性損毀抑制PD相關的DA能神經(jīng)性退化。另有研究［15］報道，對 6-OHDA 誘導的 PD 模型大鼠給予 RAPA預處理，可以通過抑制氧化應激起到抗氧化、抗凋亡的作用，有效保護DA能神經(jīng)元。本研究使用老齡的SAMP8系制成PD模型，給予RAPA制作模型前、中、后的處理，從抑制老齡小鼠線粒體損傷的角度進行觀察分析，發(fā)現(xiàn)RAPA確實能夠改善PD小鼠的運動功能和DA水平，其降低的線粒體膜電位和線粒體復合物Ⅰ活性均明顯增高；同時，本研究設計了不同劑量的RAPA進行干預，發(fā)現(xiàn)不同劑量組的效果一致，證實RAPA對老齡PD模型小鼠具有保護作用，為臨床診治PD提供了新的思路，但具體的使用劑量和相關機制需要進一步的探索。

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（編輯 王又冬）

Protective Effect of Rapamycin against Mitochondrial Injury in an Aging Parkinson’s Disease Mouse Model

ZHANG Zhongxia，MA Xiaowei，WANG Yanyong，QIU Huiqing，WANG Mingwei

（Department of Neurology，the First Hospital of Hebei Medical University，Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory of Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China）

ObjectiveTo investigate the effect of rapamycin（RAPA）on mitochondrial injury in a mouse model of aging Parkinson’s disease（PD）.MethodsForty senescence-accelerated prone mice 8（SAMP8）（12-month old）were randomly divided into 5 groups：blank group，model group，and RAPA low-，middle-，and high-dose groups.Mice in the model group and three RAPA groups were administered a subcutaneous injection of MPTP to generate the PD model.RAPA at 1，2，and 4 mg·kg-1·d-1was administered from 7 days before，5 days during，and 7 days after the PD model preparation to the RAPA groups；an equal volume of sterile saline was administered to the other two groups.After the administration，behavioral test scores，dopamine levels，transmembrane potential of mitochondria，and activity of mitochondrial complexⅠ in the 5 groups were evaluated.ResultsBehavioral scores，dopamine levels，transmembrane potential，mitochondrial complex Ⅰ activity of mice in the model group were significantly decreased compared with the blank group（P ＜ 0.05 respectively）.All indexes in the RAPA groups were significantly improved compared to the model group（P ＜ 0.05 respectively）.There was no significant difference among the three RAPA groups.ConclusionRAPA has a protective effect on aging PD model mice，and its mechanism may be related to the protection against mitochondrial damage.

rapamycin；aging；Parkinson’s disease；mitochondria

R743

A

0258-4646（2017）09-0783-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.008.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.004

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃（20160202）；河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院“星火”青年科研項目（XH201711）

張忠霞（1982-），女，主管技師，碩士.

邱會卿，E-mail：807148832@qq.com

2016-12-05

網(wǎng)絡出版時間：2017-09-06 13:17