申亞麗，蔣昆，張敏麗，蘇艷紅，張大慶

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

利拉魯肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群分化的影響

申亞麗，蔣昆，張敏麗，蘇艷紅，張大慶

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

目的探討利拉魯肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞亞群分化的影響及其機(jī)制。方法制備小鼠脾臟原代細(xì)胞懸液，高糖刺激誘導(dǎo)單核細(xì)胞亞群分化，進(jìn)一步采用利拉魯肽進(jìn)行干預(yù)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核細(xì)胞亞群分化情況，依據(jù)Ly6C的表達(dá)量將單核細(xì)胞分為 Ly6Clow，Ly6Cmid，Ly6Chi3 個(gè)亞群。再以 2’，7’-二氯熒光黃-二醋酸鹽（DCFH-DA）標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氯熒光黃（DCF）的熒光強(qiáng)度，評(píng)估各單核細(xì)胞亞群的活性氧簇（ROS）水平。結(jié)果15，25，35 mmol/L 葡萄糖可濃度依賴性地促進(jìn) Ly6Chi和 Ly6Cmid單核細(xì)胞亞群分化，且能增加 Ly6C+單核細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生，而對(duì) Ly6C-單核細(xì)胞中 ROS 的水平?jīng)]有影響。100 U、200 U 利拉魯肽濃度依賴性地抑制高糖誘導(dǎo)的 Ly6Cmid和 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群分化，并使 Ly6Clow單核細(xì)胞亞群明顯增加。利拉魯肽顯著抑制高糖誘導(dǎo)的 Ly6C+單核細(xì)胞中 ROS平，但對(duì) Ly6C-單核細(xì)胞中的 ROS無(wú)影響。結(jié)論利拉魯肽可抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群分化，并減少ROS的產(chǎn)生。

利拉魯肽；糖尿??；氧化應(yīng)激；炎癥單核細(xì)胞

研究［1］表明，2 型糖尿病患者心血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病患者的2～4倍，約有70%的2型糖尿病患者死于心血管并發(fā)癥。糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生早，病變彌漫且重，預(yù)后差［2］。探討糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)因素具有重要價(jià)值。

最近，研究［3-4］證實(shí)人和小鼠的單核細(xì)胞均具有異質(zhì)性，不同單核細(xì)胞亞群對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的貢獻(xiàn)不同。根據(jù)其表面Ly6C的表達(dá)情況，將單核細(xì)胞 分 為 3 個(gè) 亞 群：Ly6Chi，Ly6Cmid和 Ly6Clow。 前 期 研究［3-4］證實(shí)，Ly6Chi，Ly6Cmid為炎癥單核細(xì)胞，具有分泌炎性細(xì)胞因子、分化形成動(dòng)脈壁內(nèi)巨噬細(xì)胞、加重動(dòng)脈粥硬化病變的作用，Ly6Clow為抗炎癥單核細(xì)胞，能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。最新研究［5］證實(shí)，高糖能促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠炎癥單核細(xì)胞的分化，參與動(dòng)脈粥樣硬化病變形成，可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，但具體干預(yù)機(jī)制尚不明確。目前研究［6］證實(shí)，新型降糖藥物胰高血糖素樣肽 1（glucagon-like-peptide-1，GLP-1）類似物（利拉魯肽）除了有控制血糖的作用外，還具有抗氧化和抗炎作用。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有大量的 GLP-1 受體蛋白表達(dá)［7］。GLP-1在動(dòng)脈粥樣硬化病變中的巨噬細(xì)胞亦有表達(dá)［8］。GLP-1類似物能減少單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，且有研究［9］顯示利拉魯肽可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制單核細(xì)胞黏附聚集以及血管內(nèi)巨噬細(xì)胞分化，從而減輕糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變。因此，推測(cè)利拉魯肽有可能通過(guò)抗氧化作用干預(yù)高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群的分化。本研究將利用小鼠脾臟原代細(xì)胞體外培養(yǎng)，進(jìn)一步探討利拉魯肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的單核細(xì)胞亞群分化的調(diào)節(jié)及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 小鼠原代脾細(xì)胞懸液的制備與培養(yǎng)

選取6～8周齡 C57野生型雄性小鼠，腹腔深度麻醉后在無(wú)菌狀態(tài)下取脾臟，于冰上用載玻片末端輕 輕 磨 勻 后 ，用 完 全 培 養(yǎng) 基（DMEM 450 mL，10% FBS 50 mL，2 mmol/L 谷 氨 酰 胺 5 mL，10 mmol/L HEPES 5 mL，0.1mmol/L 非 必 需 氨 基 酸 5 mL，1 mmol/L 丙酮酸 鈉 5 mL，50 μmol/L β -巰 基乙醇 250 μL。）沖洗2 次，細(xì)胞懸液收集后低溫離心 300g10 min，棄上清，以 3 mL 紅細(xì)胞裂解液（碧云天公司）重懸，冰 上孵育 7 min，加入 9 mL 完全培養(yǎng)基終止裂解，離心棄去上清，過(guò)濾后重懸于 1 mL 完全培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)后以每孔 1×106/mL 接種于 24 孔板，37 ℃，4% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2 高糖對(duì)單核細(xì)胞亞群分化的影響

將脾臟細(xì)胞懸液以每孔 1×106/mL 接種于 24 孔板，0 h 加入 100 U/mL IFN-γ（美國(guó) Pepeotech 公司）作為基礎(chǔ)刺激，24 h 加入終濃度為 0、15、25、35 mmol/L葡萄糖（美國(guó) Sigma公司）或等濃度的甘露醇（美國(guó)Sigma公司）作為滲透壓對(duì)照，繼續(xù) 37 ℃，4%CO2恒溫箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.3 利拉魯肽干預(yù)單核細(xì)胞亞群的分化

將脾臟細(xì)胞懸液以每孔 1×106/mL 接種于 24 孔板，0 h 加入 100 U/mL IFN-γ 作為基礎(chǔ)刺激，23 h 加入 100 nmol/L、200 nmol/L 利拉魯肽（丹麥諾和諾德公司），24 h 加入終濃度為 25 mmol/L 葡萄糖或甘露醇，繼續(xù) 37 ℃，4%CO2恒溫箱中培養(yǎng) 48 h 后收集細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

細(xì)胞收集后PBS洗滌，重懸于100 μL 染色緩沖液（美 國(guó) BD PharmingenTM公 司），加 入 0.5 μg 的 抗CD11b-PE（美 國(guó) BD PharmingenTM公 司）和 Ly6CFITC（美國(guó) BD PharmingenTM公司）抗體，4 ℃孵育 30 min，洗滌 2 遍后重懸于 200 μLPBS（美國(guó) Hyclone 公司），流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD）檢測(cè)單核細(xì)胞亞群分化情況。以SSC為縱軸，F(xiàn)SC為橫軸設(shè)門，門1為總細(xì)胞，門2為單個(gè)核細(xì)胞，門2的單個(gè)核細(xì)胞中 CD11b+為單核細(xì)胞。以 CD11b-PE 為縱軸，以Ly6C-FITC 為橫軸，根據(jù) Ly6C-FITC 表達(dá)量將其分為 Ly6Clow，Ly6Cmid，Ly6Chi3 個(gè)單核細(xì)胞亞群。

1.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）測(cè)定

用無(wú)血清培養(yǎng)液（BI）按照 1∶1 000 的比例稀釋DCFH-DA 探針（碧云天公司），終濃度為 10 μmol/L。收集細(xì)胞后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，使細(xì)胞濃度為 1×106/mL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 20 min。每5 min 顛倒一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。之后以抗-CD11b-PE、抗-Ly6C-APC（美國(guó) BD PharmingenTM公司）抗體染色 30 min，流式檢測(cè)單核細(xì)胞亞群內(nèi)ROS含量。上機(jī)時(shí)以SSC為縱軸，F(xiàn)SC為橫軸設(shè)門，門1為總細(xì)胞，門2為單個(gè)核細(xì)胞，門2的單個(gè)核細(xì)胞中CD11b+為單核細(xì)胞。以CD11b -PE 為縱軸，以 Ly6C-APC 為橫軸，將單核細(xì)胞分為L(zhǎng)y6C+、Ly6C-亞群。再以橫軸為 DCFH-DA，縱軸為細(xì)胞數(shù)，分別檢測(cè) Ly6C+、Ly6C-單核細(xì)胞中 ROS 水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以x± s表示，采用 SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖促進(jìn)脾臟原代細(xì)胞中炎癥單核細(xì)胞的分化

與 對(duì) 照 組 相 比 ，15 mmol/L、25 mmol/L 和 35 mmol/L 葡萄糖作用下分別使 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群增加了 126% 、146% 和 168%（P 分 別 為 0.041、0.026、0.019），而 Ly6Cmid單核細(xì)胞亞群增加了 124%、145%和 152%（P 分別為 0.043、0.026、0.020）。作為等滲對(duì)照，不同濃度的甘露醇對(duì) Ly6Chi以及 Ly6Cmid單核細(xì)胞亞群的分化沒(méi)有影響。葡萄糖以及甘露醇對(duì)Ly6Clow單核細(xì)胞亞群的分化沒(méi)有影響。見(jiàn)圖 1、表1。

圖1 小鼠脾臟炎癥單核細(xì)胞亞群分化的流式分析Fig.1 Flow cytometry analysis of inflammatory monocyte differentiation in primary cultured mouse splenocytes

表1 高糖促進(jìn)小鼠脾臟炎癥單核細(xì)胞亞群的分化Tab.1 High glucose promotes inflammatory monocyte differentiation in primary cultured splenocytes

2.2 高糖增加脾臟原代細(xì)胞中炎癥單核細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

檢測(cè)高糖干預(yù)后各單核細(xì)胞亞群中ROS水平，以DCF+表示各細(xì)胞亞群內(nèi)ROS的水平。對(duì)照組中Ly6C+單核細(xì)胞亞群中 ROS 水平約是 Ly6C-單核細(xì)胞的 1.58 倍。15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L 葡萄糖干預(yù)顯著增加 Ly6C+單核細(xì)胞亞群中 ROS 水平，分別 為 120% 、131% ，158%（P分 別 為 0.025、0.004、＜0.001），且具有濃度依賴性［25 mmol/L 較 15 mmol/L明顯增加（P=0.003），35 mmol/L 較 25 mmol/L 明顯增加（P=0.007）］。作為等滲對(duì)照的甘露醇組對(duì)Ly6C+單核細(xì)胞亞群中 ROS 的產(chǎn)生沒(méi)有影響。葡萄糖及甘露醇均未能對(duì)Ly6C-單核細(xì)胞中ROS產(chǎn)生顯著影響（圖2、表2）。

2.3 利拉魯肽抑制高糖誘導(dǎo)的脾臟原代細(xì)胞中炎癥單核細(xì)胞亞群的分化

結(jié)果顯示，25 mmol/L 的高糖使 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群增加 143%（P=0.001），Ly6Cmid單核細(xì)胞亞群增加 126%（P=0.013），Ly6Clow單核細(xì)胞亞群沒(méi)有變化（105%）。100 nmol/L 和 200 nmol/L 利拉魯肽分別使高糖誘導(dǎo)的 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群降到 122%和 105%（P分別為 0.001、0.040），Ly6Cmid單核細(xì)胞亞群降到118% 和 108%（P 分 別 為 0.013、0.030），并 且 200 nmol/L 與 100 nmol/L 利拉魯肽比較 Ly6Cmid單核細(xì)胞降低更明顯（P=0.042）。在 100 nmol/L 和 200 nmol/L利 拉 魯 肽 的 干 預(yù) 下 ，Ly6Clow單 核 細(xì) 胞 亞 群 增 加 至115%和 123%（P分別為 0.009、＜0.001），見(jiàn)圖 3、表3。

圖2 Ly-6C+單核細(xì)胞亞群活性氧的流式測(cè)定Fig.2 Flow cytometry analysis of ROS production in Ly6C+monocytes

表2 高糖誘導(dǎo)下小鼠脾臟單核細(xì)胞中活性氧的測(cè)定Tab.2 High glucose enhances ROS production in Ly6C+monocytes in primary cultured splenocytes

2.4 利拉魯肽能抑制脾臟原代細(xì)胞中炎癥單核細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

檢測(cè)利拉魯肽干預(yù)后單核細(xì)胞亞群中ROS水平結(jié)果顯示，25 mmol/L 的葡萄糖使 Ly6C+單核細(xì)胞中的 ROS 水平增加 123%（P=0.035）。 100 nmol/L和 200 nmol/L 利拉魯肽分別使高糖誘導(dǎo)的 Ly6C+單核細(xì)胞中ROS水平減少，分別為87%和74%（P分別為 0.022、0.006），200 nmol/L 利拉魯肽優(yōu)于 100 nmol/L（P=0.041）。而 25 mmol/L 葡萄糖未能增加 Ly6C-單核細(xì)胞中 ROS水平。利拉魯肽對(duì) Ly6C-單核細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生沒(méi)有影響，見(jiàn)圖4、表4。

3 討論

圖3 利拉魯肽抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群分化的流式分析Fig.3 Flow cytometry analysis shows that liraglutide inhibits inflammatory monocyte differentiation induced by high glucose in primary cultured splenocytes

糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化病變出現(xiàn)早，程度重、且彌漫，前期研究［5］證實(shí)了不同單核細(xì)胞亞群對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變的貢獻(xiàn)不同，但有關(guān)機(jī)制和干預(yù)方法尚不清楚。在本項(xiàng)研究中，利用體外培養(yǎng)的小鼠脾臟單核細(xì)胞觀察到高糖刺激炎癥單核細(xì)胞亞群分化，并能促進(jìn)炎癥單核細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。利拉魯肽的干預(yù)可顯著抑制高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群的分化，且能減少炎癥單核細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。

循環(huán)中的單核細(xì)胞黏附、聚集到內(nèi)皮下分化成巨噬細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展［3-4］。最新研究［3-5］發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞亞群根據(jù)其表面 Ly6C的表達(dá)可以 為 Ly6Chi、Ly6Cmid和 Ly6Clow，其中 Ly6Chi和 Ly6Cmid有促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用，被稱為炎癥單核細(xì)胞亞群，而 Ly6Clow具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。本研究首先證實(shí)了高糖可劑量依賴性促進(jìn)Ly6Chi和 Ly6Cmid炎癥單核細(xì)胞亞群的分化。進(jìn)一步采用DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，Ly6C+單核細(xì)胞亞群產(chǎn)生 ROS 水平顯著高于Ly6C-單核細(xì)胞亞群，支持 Ly6C+單核細(xì)胞亞群為炎癥單核細(xì)胞亞群，并參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)。高糖顯著增加炎癥單核細(xì)胞亞群中ROS的產(chǎn)生，提示高糖誘導(dǎo)炎癥單核細(xì)胞亞群分化可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

表3 利拉魯肽對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠脾臟單核細(xì)胞亞群的分化Tab.3 Liraglutide inhibits inflammatory monocyte differentiation induced by high glucose in primary cultured splenocytes

圖4 利拉魯肽抑制高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群內(nèi)ROS的流式測(cè)定Fig.4 Flow cytometry analysis of ROS production in inflammatory monocytes induced by high glucose in primary cultured splenocytes

表4 利拉魯肽抑制高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群內(nèi)ROS的產(chǎn)生Tab.4 Liraglutide inhibits ROS production in inflammatory monocytes induced by high glucose in primary cultured splenocytes

利拉魯肽作為一種新型的降糖藥物，目前研究顯示其具有抑制炎癥反應(yīng)［10-11］及拮抗氧化應(yīng)激的作用［12-13］。本研究觀察到利拉魯肽可抑制高糖刺激下的炎癥單核細(xì)胞亞群的分化，并促進(jìn)單核細(xì)胞亞群向 Ly6Clow方向分化，為利拉魯肽抗動(dòng)脈粥樣硬化病變的機(jī)制提供線索。利拉魯肽可顯著抑制高糖所誘導(dǎo)的 Ly6C+單核細(xì)胞亞群中 DCF+細(xì)胞的數(shù)量、而對(duì) Ly6C-單核細(xì)胞中 DCF+細(xì)胞數(shù)量無(wú)影響，說(shuō)明利拉魯肽干預(yù)選擇性抑制了炎癥單核細(xì)胞亞群中ROS的產(chǎn)生。ROS作為氧化應(yīng)激損傷的主要標(biāo)志物，其減少意味著氧化應(yīng)激反應(yīng)被抑制，提示利拉魯肽有可能通過(guò)抗氧化作用減少高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群的分化，并減少高糖條件下氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，新型降糖藥物利拉魯肽可抑制高糖所誘導(dǎo)的炎癥單核細(xì)胞亞群分化，并減少ROS的產(chǎn)生，提示利拉魯肽可有效干預(yù)高糖所致炎癥單核細(xì)胞的分化、且可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，本研究為糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變的防治開(kāi)辟新的思路。

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（編輯 武玉欣）

Liraglutide Inhibits Inflammatory Monocyte Differentiation Induced by High Glucose

SHEN Yali，JIANG Kun，ZHANG Minli，SU Yanhong，ZHANG Daqing
（Department of Cardiology，Shengjing Hospital，China Medical University 110004，China）

ObjectiveTo explore the mechanism by which liraglutide modulated the differentiation of monocyte subsets in high glucose（HG）conditions.MethodsPrimary mouse splenocyte suspensions were cultured in HG conditions induced by IFN-γ in the presence or absence of liraglutide.The cells were harvested，co-incubated with antibodies，and analyzed on a BD FACS Calibur.Mononuclear cells（MNCs）were gated according to lower granularity and larger size by SSC and FSC.Monocytes（MCs）were defined as CD11b+MNC and divided into three subsets based on Ly6C expression：Ly6Clow，Ly6Cmid，and Ly6Chi.ROS production in Ly6C+and Ly6C-MCs was detected by 2’，7’-dichlorofluorescein-diacetate（DCFH-DA）staining and ROS-containing MCs were identified as DCF+cells in both Ly6C+and Ly6C-MCs.ResultsHG（15 mmol/L，25 mmol/ L，35 mmol/L）dose-dependently increased Ly6Chiand Ly6CmidMC differentiation and also enhanced the production of ROS in Ly6C+MCs.Liraglutide（100 U，200 U）dose-dependently inhibited HG-induced Ly6Chiand Ly6CmidMC differentiation and also promoted the differentiation of Ly6ClowMCs.Moreover，liraglutide significantly inhibited HG-induced ROS production in Ly6C+MCs.ConclusionLiraglutide treatment significantly inhibited inflammatory MC differentiation induced by HG and also reduced ROS production in inflammatory MCs.

liraglutide；diabetes mellitus；oxidative stress；inflammatory monocyte

R541.4

A

0258-4646（2017）09-0773-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.004.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（81200199）；遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長(zhǎng)計(jì)劃（LJQ2015117）

申亞麗（1989-），女，醫(yī)師，碩士研究生.

張大慶，E-mail：zhangdaqing@vip.163.com

2016-12-09

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-09-06 13:17