趙彥楠，劉洪祥，馬曉欣

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

·論著·

晚期糖基化終產(chǎn)物受體在多囊卵巢綜合征大鼠模型中的表達(dá)

趙彥楠，劉洪祥，馬曉欣

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

目的研究晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）及血清中可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）在脫氫表雄酮誘導(dǎo)的大鼠模型中的表達(dá)，并進(jìn)一步探討sRAGE對(duì)卵巢功能的影響。方法采用脫氫表雄酮聯(lián)合高脂飲食造模法建立多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型。造模成功后，選用競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 法檢測(cè)血清中 sRAGE 及抗苗勒管激素（AMH）表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠模型卵巢組織中 RAGE 的表達(dá)。結(jié)果RAGE 在模型組卵巢組織中顯著高表達(dá)（P ＜ 0.01）。模型組血清 sRAGE 水平明顯低于對(duì)照組（P ＜ 0.05），血清 AMH 含量高于對(duì)照組（P＜ 0.05），且 sRAGE 與 AMH 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論RAGE 及 sRAGE 對(duì)PCOS的診斷和發(fā)病機(jī)制以及對(duì)卵巢功能的影響均有重要的參考價(jià)值。

多囊卵巢綜合征；晚期糖基化終產(chǎn)物受體；大鼠模型

晚 期 糖 基 化 終 末 產(chǎn) 物 受 體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是免疫球蛋白超家族成員，屬于多配體受體，在膜表面與其配體結(jié)合后可引起細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷［1］?？扇苄酝砥谔腔K產(chǎn)物受體（soluble form of receptor for advanced glycation end prod-ucts，sRAGE）是 RAGE 的一種異形體，由多種細(xì)胞合成、分泌，在循環(huán)系統(tǒng)中含量很高［2］。由于 sRAGE缺乏受體膜鑲嵌區(qū)域與胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，無(wú)法完成細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以特異性結(jié)合其配體晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs），從 而 阻斷促炎、促凝反應(yīng)以及腫瘤發(fā)生等多種病理生理過(guò)程［3］。多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見(jiàn)的一種生殖內(nèi)分泌代謝障礙疾?。?］。研究［5］發(fā)現(xiàn) PCOS 患者體內(nèi) C 反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α等多種炎性細(xì)胞因子水平均高于正常人。近年來(lái)一系列炎性失調(diào)疾病的研究發(fā)現(xiàn)，sRAGE在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和慢性阻塞性肺疾病等疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，被認(rèn)為是一種可靠的炎癥標(biāo)志物［6］。但sRAGE、RAGE對(duì)PCOS的影響還知之甚少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）聯(lián)合高脂飲食法制作的 PCOS 大鼠模型出現(xiàn)的卵巢病理改變及激素水平改變等典型內(nèi)分泌變化與PCOS患者相似，是一種較為理想的PCOS動(dòng)物模型。本研究通過(guò)建立PCOS大鼠模型，研究RAGE、sRAGE 在PCOS大鼠模型中的表達(dá)，探討其對(duì)PCOS的臨床意義并進(jìn)一步探討其對(duì)卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

選取 40 只 21 日齡雌性 SD 大鼠，體質(zhì)量 200～250 g，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)本溪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠 sRAGE-ELISA 試劑盒、大鼠 AMH-ELISA 試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Cloud-Clone 公司；兔多克隆抗體 RAGE購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組化SP試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立 PCOS 模型：采用隨機(jī)數(shù)字表法將 40 只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=20）和對(duì)照組（n=20）。每只大鼠均自由進(jìn)食，自由飲水，室溫（22.0±3.0）℃，照明采用晝夜亮暗周期循環(huán)。將 DHEA（60 mg/kg）溶于 0.2 mL 注射油劑中，模型組大鼠每日頸背部皮下注射 DEHA+注射油 劑 0.2 mL，同時(shí)喂以高 脂 飼料，連續(xù) 8 周；對(duì)照組大鼠每日頸背部皮下注射 0.2 mL注射油劑，連續(xù)8周。

1.2.2 標(biāo)本采集：造模成功后腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血約5 mL，分離血清，-80 °C凍存?zhèn)溆?。分離摘取雙側(cè)卵巢，修剪多余組織及脂肪組織后，雙側(cè)卵巢置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片待測(cè)。

1.2.3 血清中 sRAGE 和 AMH 測(cè)定：ELISA 法檢測(cè)血清中sRAGE和 AMH水平。操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，450 nm 波長(zhǎng)酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色：檢測(cè)方法采用免疫組化SP法，進(jìn)行RAGE免疫組化染色，一抗?jié)舛认♂尀?∶20，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下觀察為棕黃色顆粒即RAGE表達(dá)陽(yáng)性。高倍鏡下每例隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野，估計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)后取均值。按陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分；按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。2項(xiàng)相乘后取平均值，0～4分為陰性表達(dá)，＞4分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x± s描述，組間比較采用t檢驗(yàn)。2組間RAGE陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用 Pearson 檢驗(yàn)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)比較

光學(xué)顯微鏡下卵巢HE染色可見(jiàn)對(duì)照組卵巢形態(tài)正常，卵泡發(fā)育正常，皮質(zhì)可見(jiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及黃體。模型組鏡下可見(jiàn)較多閉鎖卵泡及囊性擴(kuò)張性卵泡且多集中在卵巢邊緣，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯減少甚至消失，卵巢呈典型的多囊樣變，符合多囊卵巢病理改變。見(jiàn)圖1。

2.2 2組大鼠血清中 sRAGE和AMH水平比較

2.2.1 血清 sRAGE 水平比較：模型組和對(duì)照組血清中 sRAGE 含 量 分 別 為（0.19 ± 0.02）和（1.96 ± 0.17）ng/mL，模型組血清中 sRAGE 水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 2組大鼠卵巢組織HE染色切片 ×4Fig.1 HE staining of ovarian tissue from the control and PCOS groups ×4

2.2.2 血清 AMH 水平比較：模型組和對(duì)照組血清中AMH 含量分別為（5 293.8±333.2）和（3 591.9±224.9）pg/mL，模型組血清中AMH水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.2.3 模型組血清 sRAGE 與 AMH 濃度相關(guān)性：直線相關(guān)性分析顯示，模型組的血清sARGE與AMH濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.734，P＜ 0.05）。

2.3 RAGE在PCOS大鼠模型卵巢中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，RAGE主要位于卵巢顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核上。對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞染色強(qiáng)度減弱，甚至未見(jiàn)染色（圖2A）。模型組中RAGE在卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞胞質(zhì)以及部分內(nèi)皮細(xì)胞呈棕褐色顆粒，呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)（圖2B）。對(duì)照組和模型組RAGE的陽(yáng)性表達(dá)率分別為 15%（3/20）和 90%（18/20），半定量分析RAGE表達(dá)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，RAGE在模型組卵巢組織中呈顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.56，P＜ 0.01）。

圖2 免疫組化法觀察RAGE在PCOS大鼠模型卵巢中的表達(dá) ×100Fig.2 Immunohistochemical analysis of RAGE expression in the PCOS rat model ×100

3 討論

PCOS是一種以胰島素抵抗及高雄激素血癥為核心病理機(jī)制，與生殖、內(nèi)分泌密切相關(guān)的全身性代謝障礙性疾?。?］。越來(lái)越多證據(jù)顯示，PCOS 患者機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性低度炎癥狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致患者生殖與代謝障礙的重要原因［8］。其體內(nèi)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素18等炎性細(xì)胞因子水平往往升高，且與雄激素水平及胰島素抵抗呈正相關(guān)［9］。RAGE是一種跨膜蛋白，在體內(nèi)多種組織中均有表達(dá)，如心、肺、骨骼肌、卵巢等［10］。但當(dāng)組織中出現(xiàn)氧化應(yīng)激或RAGE配體聚集時(shí)，RAGE表達(dá)明顯上調(diào)，形成正反饋?zhàn)饔?，使?xì)胞處于持續(xù)激活狀態(tài)，導(dǎo)致快速的細(xì)胞活化 及 促炎癥轉(zhuǎn)錄因子水 平 持 續(xù)升高［11］。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)RAGE在模型組與對(duì)照組卵巢組織中的蛋白表達(dá)，證實(shí)RAGE在模型組卵巢顆粒細(xì)胞中呈高表達(dá)，與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AGEs在PCOS大鼠模型卵巢組織中表達(dá)升高的結(jié)果一致，提示RAGE與PCOS發(fā)生密切相關(guān)。并且可能是通過(guò)與其配體AGEs結(jié)合，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的形成，進(jìn)而造成顆粒細(xì)胞損傷及功能紊亂［12］。

相對(duì)于RAGE，sRAGE被認(rèn)為是一種“好”受體，由 RAGE 選擇性剪切產(chǎn)生［13］。其主要存在于循環(huán)系統(tǒng)中，可阻止AGEs或其他配體與RAGE結(jié)合，從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用［14］。糖尿病大鼠模型研究顯示，sRAGE 經(jīng)腹腔注射后可干擾 AGEs-RAGE 相互作用，減少蛋白尿及抑制動(dòng)脈粥樣硬化的早期形成［15］。由此可見(jiàn)，sRAGE 可能是 PCOS 的保護(hù)因素，能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合模型組大鼠體內(nèi)堆積的AGEs，故使血清中游離的sRAGE水平降低，因此模型組血清中sRAGE的水平明顯低于對(duì)照組。

AMH由顆粒細(xì)胞分泌，由于其在人體水平不受月經(jīng)影響，又十分靈敏，在評(píng)價(jià)卵巢功能方面是一個(gè)良好的指標(biāo)［16］。它通過(guò)降低卵泡對(duì)卵泡刺激素的敏感性以及抑制顆粒細(xì)胞芳香酶的活性起到抑制卵泡發(fā)育的作用，在卵泡的募集中起到重要的作用［17］。DEWAILLY 等［18］發(fā)現(xiàn)，AMH 水平升高能夠提示PCOS患者排卵障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清AMH濃度明顯高于對(duì)照組，提示PCOS大鼠模型可能存在排卵障礙。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，血清sRAGE濃度與AMH呈負(fù)相關(guān)。由此可見(jiàn)，sRAGE可能間接反映卵巢功能，其機(jī)制可能是其結(jié)合血液中及卵泡液中累積的AGEs，進(jìn)而減少對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及促炎性細(xì)胞因子的釋放［19］。

PCOS作為一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、由環(huán)境與致病基因共同作用導(dǎo)致的疾病，目前尚無(wú)根治方法。并且，其遠(yuǎn)期并發(fā)癥如2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、子宮內(nèi)膜癌等更是給女性身心鍵康帶來(lái)傷害［20］。若能夠早期做出診斷，進(jìn)行針對(duì)性治療，可有效改善患者預(yù)后。本研究證明RAGE在PCOS大鼠模型組卵巢組織中表達(dá)明顯升高，提示RAGE可能通過(guò)某種途徑參與PCOS的發(fā)病過(guò)程，為PCOS的治療提供新的靶點(diǎn)。模型組血清中sRAGE顯著降低，可能是PCOS的保護(hù)因素，也為PCOS的輔助診斷提供一定依據(jù)。同時(shí)，sRAGE 濃度與 AMH 呈負(fù)相關(guān)，提示sRAGE 不僅能夠作為PCOS診斷的標(biāo)志物，也可能是卵巢功能的潛在評(píng)估指標(biāo)。但RAGE、sRAGE 影響卵泡發(fā)育以及卵巢功能的機(jī)制尚不完全清楚，有待更多深入研究來(lái)揭示。

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（編輯 陳 姜）

Expression of Receptor for Advanced Glycation End Products in a Rat Model of Polycystic Ovarian Syndrome

ZHAO Yannan，LIU Hongxiang，MA Xiaoxin

（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression of receptor for advanced glycation end products（RAGE）and soluble RAGE（sRAGE）in a rat model of dehydroepiandrosterone-induced polycystic ovary syndrome（PCOS）and to explore the role of sRAGE in ovarian function.MethodsThe PCOS rat model was established using dehydroepiandrosterone in combination with a high-fat diet.In animals with confirmed PCOS induction，serum concentrations of sRAGE and AMH were measured by competitive ELISA，and RAGE expression in ovarian tissues was detected by immunohistochemistry.ResultsRAGE expression was significantly higher in the PCOS group than in the control group（P ＜ 0.01）.Serum concentrations of sRAGE and AMH were significantly lower and higher than those in the control group（P ＜ 0.05），respectively.Furthermore，sRAGE level was negatively correlated to that of AMH.ConclusionRAGE and sRAGE levels influence ovarian function and have substantial reference value in the diagnosis and pathogenesis of PCOS.

polycystic ovarian syndrome；receptor for advanced glycation end products；rat model

R711.75

A

0258-4646（2017）09-0769-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1317.002.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472438，81272874）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2013225079）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（F14-158-9-47）；盛京自由研究者基金

趙彥楠（1993-），女，碩士研究生.

馬曉欣，E-mail：maxiaoxin666@aliyun.com

2017-03-16

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-09-06 13:17