□ 王成梅 辛 堃 山東中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司 曹文波 清華大學(xué)精儀系

高速動(dòng)能破碎L(zhǎng)C-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物性肉粉調(diào)味料中硝基呋喃代謝物殘留

□ 王成梅 辛 堃 山東中質(zhì)華檢測(cè)試檢驗(yàn)有限公司 曹文波 清華大學(xué)精儀系

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了超聲快速衍生和傳統(tǒng)振蕩衍生的效果，優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及衍生條件。通過0．5、1．0、2．0三個(gè)濃度的加標(biāo)回收，硝基

代謝物的回收率在90．7%～101．3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。在0．5～10 μg/kg時(shí)線性關(guān)系良好（r＞0．992），檢出限為0．25 μg/kg。本方法快速、高效，而且可以大大節(jié)約時(shí)間和成本，提高了工作效率。

動(dòng)物性肉粉；高速動(dòng)能破碎；LC-MS/MS

目前，硝基呋喃類代謝物殘留的檢測(cè)最普遍的方法是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1]。在檢測(cè)硝基呋喃代謝物殘留的過程中需要經(jīng)過酸水解，主要是因?yàn)樵谒嵝詶l件下硝基呋喃代謝物可以和蛋白質(zhì)分離[2]。本實(shí)驗(yàn)中首先通過高速動(dòng)能破碎儀對(duì)樣品進(jìn)行60 s的高速均質(zhì)破碎，使得樣品破碎程度高，避免了提取過程中的乳化現(xiàn)象，同時(shí)采用避光水浴 40 ℃超聲提取1 h。結(jié)果表明，采用該方法不僅能夠大幅縮短反應(yīng)時(shí)間，而且重現(xiàn)性好精密度高，實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)硝基呋喃代謝物的要求。在實(shí)驗(yàn)過程中采用同位素內(nèi)標(biāo)法，提高定量的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和試劑

儀器：Agilent液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1260-6460）；高速動(dòng)能均質(zhì)儀；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；恒溫水浴搖床；渦旋混合器；電子天平；pH計(jì)。

硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)品：3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）；5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）；1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）；氨基脲（SEM）以及同位素內(nèi)標(biāo)AOZD4和AMOZ-D5購(gòu)于德國(guó)Dr.E公司；AHD-13C 和SEM. HCl-13C-15N2，購(gòu)于德國(guó)Witega公司。

試劑：2-硝基苯甲醛；甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸（HPLC級(jí)）；乙酸乙酯、正己烷、1 mol/L氫氧化鈉、0.2 mol/L鹽酸和2 mol/L磷酸氫二鉀（分析純）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

四種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)配液，-18 ℃冷凍避光保存。

四種硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 μg/mL）：取適量的硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋成10 μg/mL的混合工作使用液，-18 ℃冷藏避光保存，使用前回到室溫左右。

氘代內(nèi)標(biāo)混合液儲(chǔ)備液（1 mg/ mL）：分別準(zhǔn)確氘代內(nèi)標(biāo)物用甲醇溶解，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冷凍避光保存，有效期為6個(gè)月。

氘代內(nèi)標(biāo)混合工作使用液（0.1 mg/L）：準(zhǔn)確吸取一定量的氘代內(nèi)標(biāo)混合工作儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成濃度為0.1 mg/L的混合工作使用液，冷藏避光保存，有效期為1個(gè)月。

2-硝基苯甲醛衍生溶液：準(zhǔn)確稱取0.15 g 2-硝基苯甲醛，用甲醇定容至10 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

水解和衍生：稱取2 g經(jīng)過高速動(dòng)能破碎儀高速均質(zhì)的樣品于50 mL的離心管中，加入10 mL 0.2 mol/L的鹽酸高速均質(zhì)進(jìn)行酸解。加入1 mg/L混合內(nèi)標(biāo)工作液100 μL和100 μL 2-硝基苯甲醛衍生試劑，渦旋混勻30 s，避光水浴40 ℃超聲震蕩1 h。

提?。喝〕鰳悠?，冷卻至室溫。用1 mol/L的磷酸氫二鉀和2 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。加入5 mL乙酸乙酯， 渦混勻，9 000 r/ min離心5 min，重復(fù)提取1次合并上層清液至10 mL離心管中，于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，殘留物用1 mL甲酸（0.1%）水溶液溶解。再加入3 mL 正己烷去脂 渦混勻1 min后，以9 000 r/min離心5 min，取下層過0.22 μm濾膜上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

Agilent高效液相色譜柱為 Eclipse Plus C18（2.7 μm，2.1 mm×50 mm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫條件見表1。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；正離子模式下多重反應(yīng)檢測(cè)；毛細(xì)管電壓：4 000 V；離子源溫度：350 ℃；脫溶劑氣壓力：40 psi；脫溶劑氣流量：11 L/min。MRM 分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

研究發(fā)現(xiàn)40 ℃超聲避光振蕩1 h以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨于穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。使用磷酸氫二鉀和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，不同樣品加入量有區(qū)別，每個(gè)樣品都要仔細(xì)加入不同的量，來回調(diào)整耗時(shí)長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH值在7.0～7.5時(shí)，效果好且沒有顯著區(qū)別。利用前幾個(gè)樣品摸索好加入緩沖液的量，可以進(jìn)一步縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

流動(dòng)相初始溶液溶解樣品后，對(duì)于脂肪含量較高的樣品，由于基質(zhì)干擾嚴(yán)重，直接過膜上機(jī)其液體非常渾濁，采用3 mL正己烷去脂，過膜，上機(jī)液清澈，基質(zhì)干擾小。研究發(fā)現(xiàn)，加入正己烷結(jié)合高速離心，除雜質(zhì)效果更好。

筆者選用了雞肉、魚肉粉等作為實(shí)驗(yàn)樣品。實(shí)驗(yàn)通過一種高速動(dòng)能破碎儀，使樣品在極短的時(shí)間可進(jìn)行高速地均質(zhì)，造成組織和細(xì)胞破碎、代謝物流出，避免在提取過程中由于基質(zhì)復(fù)雜且含油量大而造成的乳化現(xiàn)象，有利于提高提取率，縮短提取時(shí)間。四種硝基呋喃代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，見表3。

本實(shí)驗(yàn)采用高速動(dòng)能破碎儀，不僅可以使樣品分散均勻，避免在提取過程中造成油脂過高的乳化現(xiàn)象，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中采用高速冷凍離心進(jìn)一步凈化樣品。前處理時(shí)間短、提取率高，在很大程度避免了基質(zhì)復(fù)雜提取過程中造成的乳化現(xiàn)象，非常適合調(diào)味料粉中硝基呋喃代謝物類的檢測(cè)。

3 結(jié)語

呋喃代謝物在酸性條件下可以和蛋白質(zhì)分離，加入衍生試劑后可以形成比較大的分子避開小分子離子的干擾，獲得較高的靈敏度和特異性。而衍生在本實(shí)驗(yàn)中通過改進(jìn)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①本實(shí)驗(yàn)建立了一種高速動(dòng)能提取動(dòng)物性肉粉調(diào)味料中硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)方法，提高了工作效率，縮短了時(shí)間；②采用高速動(dòng)能破碎儀對(duì)樣品進(jìn)行高速均質(zhì)，使樣品最大程度地分散，不僅可以有效降低乳化現(xiàn)象，并有助于分層提取，提高回收率。而且樣品處理過程時(shí)間短，大大提高了工作效率；③改進(jìn)前處理過程，采用了水浴超聲快速衍生的方法，通過40 ℃超聲避光提取1 h，比傳統(tǒng)的16 h衍生水解縮短了提取時(shí)間，提高了工作效率，而且重現(xiàn)性好精密度高；④對(duì)于脂肪含量較高的樣品，加入正己烷結(jié)合高速離心，可以提高除雜質(zhì)效果；⑤在分析復(fù)雜基質(zhì)LC-MS/MS時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)，影響定量分析的準(zhǔn)確性和精明度。本實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)法，減少了外標(biāo)法過程中存在的干擾，使定量變得更準(zhǔn)確。

表1 四種硝基呋喃類代謝物的液相色譜條件表

表2 硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件

表3 硝基呋喃類代謝物的線性、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限表

[1]賈濤．飼料中硝基 類藥物的檢測(cè)研究進(jìn)展[J]．飼料與畜牧，2011(7)：37-40．

[2]蔣原，丁濤，沈崇 ，等．液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)蜂蜜中四種硝基 類代謝物[J]．畜牧與獸醫(yī)，2005(3)：12-15．