□ 蔣棟磊 葛攀瑋 俞程凱 郭 偉 葛慶豐 方維明 揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院

大豆過(guò)敏原β-伴大豆球蛋白提取純化工藝研究

□ 蔣棟磊 葛攀瑋 俞程凱 郭 偉 葛慶豐 方維明 揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院

大豆蛋白具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而其致敏性卻給大豆敏感人群帶來(lái)了極大的危害。其中7S伴大豆球蛋白是一種主要過(guò)敏原。本實(shí)驗(yàn)采用堿溶酸沉法從大豆中分離純化出β-伴大豆球蛋白（7S伴大豆球蛋白）。通過(guò)設(shè)置濃度、料液比、pH、提取液的單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)，研究對(duì)大豆球蛋白提取的影響，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯 胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)提取的7S伴大豆球蛋白進(jìn)行了純度分析。結(jié)果顯示，使用pH9．0、濃度為0．10 mol/L的Tris-HCl緩沖液在料液比1︰18的條件下，7S伴大豆球蛋白提取率為47%。

大豆蛋白；分離純化；正交試驗(yàn)

大豆蛋白質(zhì)是高品質(zhì)植物蛋白質(zhì)來(lái)源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高[1-2]。而大豆蛋白卻是一種主要的過(guò)敏原，其能引起人體嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)[3-4]。大豆中約有35%～40%的蛋白，以不同的沉降系數(shù)，可分為2S球蛋白、7S球蛋白、11S球蛋白和15S球蛋白[5-8]。其中，7S球蛋白和11S球蛋白約占大豆蛋白質(zhì)總量的70%[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)以大豆中的7S球蛋白為研究對(duì)象，設(shè)置不同的提取條件，通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白的分離純化，進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。用電泳成像儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比鑒定，建立快速高效提取大豆過(guò)敏原蛋白的方法，為大豆過(guò)敏蛋白的檢測(cè)以及大豆過(guò)敏蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備，提供一定的基礎(chǔ)性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料與試劑：優(yōu)質(zhì)黃大豆、丙酮、10%過(guò)硫酸銨溶液、Tris-HCl緩沖液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇和電泳凝膠制備試劑盒試劑等。

實(shí)驗(yàn)儀器：HJ-4A型磁力攪拌器、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、微型垂直電泳系統(tǒng)、凝膠電泳成像儀和多功能酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 大豆脫脂

粉碎機(jī)將大豆粉碎成粉末，過(guò)60目篩，收集過(guò)篩的大豆粉，4 ℃保存。大豆粉與丙酮溶液按1︰5混合（m/v），磁力攪拌1 h后進(jìn)行抽濾，收集固體，重復(fù)上述步驟數(shù)次，直至上層液體無(wú)色，4 ℃離心取沉淀，-4 ℃保存。

1.2.2 大豆蛋白浸提

控制浸提液濃度為0.05 mol/L、pH9.0、料液比1︰10，設(shè)置不同種類提取液：PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液；設(shè)置不同pH：pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0；設(shè)置不同濃度提取液：0.03、0.05、0.10 mol/L和0.20 mol/L；設(shè)置不同的料液比：1︰10、1︰15、1︰18、1︰20。提取率計(jì)算方法為：提取率=大豆提取蛋白質(zhì)量/脫脂大豆蛋白粉質(zhì)量×100%。

1.2.3 SDS-PAGE分析

建立蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品中的蛋白濃度，并將大豆蛋白樣品于PBS溶液中進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.4 大豆致敏蛋白純化和分析

將樣品封裝于透析袋（36 mm）中，透析24 h后,濃縮干燥，進(jìn)行SDSPAGE分析。采用考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素對(duì)大豆致敏蛋白浸提的影響

由圖1（A）可知，Tris-HCl緩沖液的提取率都高于PBS緩沖液的提取率，故選用Tris-HCl緩沖液為提取液；由圖1（B）可知，料液比為1︰18時(shí)，能夠提取大部分的球蛋白，故選取料液比1︰18作為最佳提取料液比；由圖1（C）可知，當(dāng)Tris-HCl提取液濃度為0.1 mol/L時(shí)，7S伴大豆球蛋白的提取率最高，最終選取0.1 mol/L為最佳提取濃度；由圖1（D）可知，pH9.0時(shí)提取率最高。最終選取pH9.0為最佳提取pH。

2.2 大豆蛋白的純化

由圖2可以發(fā)現(xiàn)，與Marker相對(duì)比較，7S球蛋白經(jīng)純化后，雜蛋白被除去，只留下7S球蛋白的主要蛋白含量Gly m Bd 30K，可知純化成功。

2.3 大豆致敏蛋白含量測(cè)定結(jié)果

建立蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.020 5x+0.147 6，其中，R2=0.991 8。經(jīng)純化透析后的7S球蛋白約16 mL，并測(cè)定其OD值為0.17，計(jì)算得純化后的蛋白含量為1.1 mg/mL，獲得7S球蛋白總量為17.6 mg。

3 結(jié)論

依據(jù)單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)，最終確定提取大豆致敏蛋白的最佳條件，并經(jīng)過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證鑒定。最佳提取條件為：提取液濃度pH9.0、提取液濃度0.10 mol/L、Tris-HCl緩沖液、料液比1︰18。通過(guò)最佳工藝提取出來(lái)的蛋白樣品，此條件下可獲得含量為1.1 mg/mL的7S球蛋白。

[1]喬娟．中國(guó)大豆國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力研究[D]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2004．

[2]朱 ．大豆過(guò)敏原的生物去除[D]．無(wú)錫：江南大學(xué)，2013．

[3]Lehrer S B, Horner W E, Reese G. When are proteins allergic Implications for biotechnology[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996(6):553-564.

[4]李 ，張施敬， 之蘊(yùn)，等．乳鐵蛋白純化和檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]．廣東化工，2014(14)：123-124．

[5]楊偉強(qiáng)，李鵬，袁濤，等．從花生蛋白粉中提取花生分離蛋白的條件優(yōu)化[J]．中國(guó)油脂，2009(1)：34-37．

[6]張宇 ，王強(qiáng)．花生蛋白的開(kāi)發(fā)與利用[J]．花生學(xué)報(bào)，2005(4)：12-16．

[7]S a m p s o n H A． U p d a t e on food allergy[J]．J Allergy Clin Immunol，2004(5)：805-819．

[8]周大寨，朱玉昌，周毅鋒，等．豆蛋白質(zhì)的提取及超濾分離研究[J]．食品科學(xué)，2008(8)：386-390．

[9]馬麗，潘寧玲，馬亞群．手術(shù)中嚴(yán)重藥物過(guò)敏反應(yīng)的診斷和處理[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2014(24)：4608-4609．

圖1 單因素對(duì)大豆致敏蛋白浸提的影響圖

圖2 透析純化的大豆球蛋白電泳圖

[10]Thanh V H， Shibasaki K． Betaconglycinin from soybean proteins． Isolation and immunological and physicochemical properties of the monomeric forms[J]．Biochimica et biophysica acta，1977(2)：370．

國(guó)家自然科學(xué)基金面上科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31271945）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：31601535）；江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：BK20 160459）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（編號(hào)：16KJB550008）；揚(yáng)州市社會(huì)發(fā)展前瞻性研究項(xiàng)目（編號(hào)：YZ2014177）。

蔣棟磊（1986—），男，江蘇無(wú)錫人，博士，講師。研究方向：食品安全檢測(cè)。

方維明（1965—），男，江蘇揚(yáng)州人，博士，教授。研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。