提金鳳，李志杰，李 舫

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

雛鴨坦布蘇病毒分離鑒定及全基因序列分析

提金鳳，李志杰，李 舫

(山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061)

山東濰坊地區(qū)某鴨場養(yǎng)殖的21日齡櫻桃谷鴨突然發(fā)病，病鴨主要表現(xiàn)翅腿癱瘓等神經(jīng)癥狀，排黃綠色或黃白色稀糞，病死率5%左右。為了確定發(fā)病鴨群感染病原的種類，首先采集病死鴨肝臟，處理后接種9日齡～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病原分離。其次，對分離的病原RT-PCR擴(kuò)增和序列測定，MEGA5繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，DNA Star軟件分析核苷酸同源性。結(jié)果表明，通過SPF雞胚分離到一株坦布蘇病毒(TMUV)，命名為TMUV-SDWF。該病毒株基因組全長為10 990 nt，編碼1個含3 426個氨基酸的多聚蛋白。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析顯示，TMUV-SDAG毒株屬于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明，TMUV-SDSG與GenBank上公布的16株不同TMUV分離株核苷酸同源性高達(dá)97.0%～99.8%。成功分離鑒定一株鴨坦布蘇病毒并對其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，為鴨坦布蘇病毒弱毒或滅活疫苗的篩選制備及該病毒分子流行病學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。

鴨坦布蘇病毒；核苷酸同源性分析；多聚蛋白

坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)最早于1955年從蚊子體內(nèi)分離得到，屬于黃病毒科、黃病毒屬中的那他亞病毒群[1-3]。坦布蘇病毒感染產(chǎn)蛋鴨后主要引起產(chǎn)蛋率急劇下降，出血性卵巢炎[4-5]；雛鴨感染后主要表現(xiàn)為扭脖、癱瘓等神經(jīng)癥狀，病死率較高[6-7]。TMUV能否通過特殊的途徑感染人類，還尚不明確，這成為人們密切關(guān)注的問題。該病毒于2010年4月在我國東南養(yǎng)鴨地區(qū)出現(xiàn)，宿主范圍廣泛，可以感染多種禽類，如北京鴨、紹興鴨、金定鴨、櫻桃谷鴨、縉云麻鴨及坎貝爾鴨等品種，也可感染雞、鵝、麻雀等家禽或野禽[8-10]。試驗(yàn)表明，TMUV還能通過腦內(nèi)途徑感染小鼠[8,11]。該病毒傳播迅速、傳播范圍廣，不到1年時間，我國絕大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)均有該病的發(fā)生，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。TMUV主要通過呼吸道、消化道感染禽類，研究表明該病毒還能通過種蛋垂直傳播，導(dǎo)致種蛋孵化率、出殼率下降，死胚及弱雛增多[12]。

由于TMUV感染的宿主廣泛，傳播速度快，為了在臨床上有效的防控該病，本研究從發(fā)病鴨場中采集病料，進(jìn)行TMUV的分離鑒定及生物信息學(xué)分析，為TMUV弱毒或滅活疫苗的篩選制備及分子流行病學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)并提供部分理論數(shù)據(jù)[13]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料、細(xì)胞及雞胚 山東濰坊某商品肉鴨基地養(yǎng)殖21日齡櫻桃谷鴨發(fā)病，主要表現(xiàn)為翅腿癱瘓等神經(jīng)癥狀，腹瀉，排黃綠色或黃白色稀糞，病死率5%左右，采集病死鴨肝臟進(jìn)行病原分離。9日齡SPF雞胚，購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院SPF雞場；BHK-21、Vero等細(xì)胞,來自山東省畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動物疫病監(jiān)測中心；5日齡雛鴨,購自山東濰坊某鴨場。

1.1.2 試劑 Random Premier、DNA凝膠純化試劑盒、TaqDNA聚合酶、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖小MD18-T試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Trizol 試劑、RNA 酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶 MLV、ddH2O等，北京全仕金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鴨酶標(biāo)二抗，KPL公司產(chǎn)品；DAB底物顯色液，北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)，電泳儀(北京市六一儀器廠)，臺式冷凍高速離心機(jī)(Beckman Coulter)，凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)。

1.2 方法

1.2.1 病毒的分離 采集發(fā)病雛鴨的肝臟，勻漿器中加入2倍～4倍體積生理鹽水后進(jìn)行研磨，研磨后的組織液反復(fù)凍融1次～2次后，12 000 r/min離心10 min。取上清，采用孔徑為0.22 μm的一次性濾器過濾除菌，將除菌后的濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡SPF雞胚，每胚接種0.2 mL。病毒在雞胚中盲傳3代，雞胚死亡時間穩(wěn)定，一般維持在2 d～3 d死亡。無菌收集死亡雞胚的尿囊液，分裝于2 mL的離心管中，置-80℃保存?zhèn)溆肹10]。

1.2.2 病毒的鑒定

1.2.2.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank 中公布的TMUV NS1的全基因序列(登錄號：KJ740748.1)設(shè)計引物，引物序列為：NS1F：5′-CTTTGGGTTTGGAGTGTTG-3′；NS1R：5′-CTTGTATCCTGTCCTCGTGTT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為313 bp。

1.2.2.2 RT-PCR 采用Trizol法提取病毒RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，即上述總 RNA 5.0 μL，5×buffer 4.0 μL，20 μmol/L隨機(jī)引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，40 U/μL RNA酶抑制劑0.5 μL，200 U/μL M-MLV 0.5 μL，ddH2O加至20 μL體積。離心混勻后進(jìn)行反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)條件如下：30℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃ 10min。

以病毒的cDNA為模板，TMUV NS1F和NS1R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，上游引物(20 mmol/L)1 μL，下游引物(20 mmol/L)1 μL，Mix 10 μL，DEPC水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 sc，50℃ 30 s，72℃ 60 s，共30個循環(huán)；最后72℃ 10 min。

PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。產(chǎn)物回收純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.2.3 病毒全基因序列測定

1.2.3.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank中公布的TMUV的全基因序列(登錄號：KJ740748.1)設(shè)計8對擴(kuò)增全基因序列的引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增TMUV基因全長的引物序列

1.2.3.2 病毒全基因擴(kuò)增 以上述擴(kuò)增的病毒cDNA為模板，利用設(shè)計的8對引物進(jìn)行TMUV全基因組的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后分別與pMD18-T連接，然后克隆至DH5α中，將菌液PCR鑒定為陽性的克隆菌送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行基因序列的測定。病毒全基因組3′末端序列和5′末端序列分別采用3′full race 試劑盒和5′full race試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 序列分析 將測序后的病毒的全基因序列通過DNA Star軟件進(jìn)行序列拼接，獲得病毒的全基因序列。將該病毒的全基因序列與GenBank中公布的16株分離自不同年份、不同時間和不同宿主的TMUV進(jìn)行BLAST同源序列比對，用MEGA5、MegAlign等軟件進(jìn)行該病毒全基因遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建及核苷酸、氨基酸同源性分析(表2)。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離

病死鴨的肝臟處理液接種雞胚后，雞胚在72 h～96 h出現(xiàn)死亡，死亡雞胚尿囊膜增厚，胚體全身出血，尤其是頸背部出血明顯(圖1)，胚體肝臟有的出現(xiàn)白色壞死點(diǎn)。

A.死亡雞胚尿囊膜增厚;B.胚體全身出血，肝臟有白色壞死點(diǎn)

A.The thickening of allantoic membrane of dead chicken embryo;B.Aemorrhage and liver necrosis with white points in chicken embryo

圖1病毒接種的雞胚

Fig.1 The chicken embryo inoculated with the virus

2.2 病毒鑒定

將收集的死亡雞胚尿囊液提取RNA，RT-PCR擴(kuò)增后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在大約313 bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。將PCR產(chǎn)物回收后測序，結(jié)果與GenBank中公布的TMUV NS1序列同源性在99.0%以上，從而確定分離的病毒為TMUV，并將其命名為TMUV-SDSG株。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.雞胚尿囊液；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.Allantoic fluid of chicken embryo;2.Negative control

圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 RT-PCR identification results

2.3 全基因組序列擴(kuò)增

利用8對設(shè)計的病毒全基因組引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，出現(xiàn)了8條目的片段(圖3)。8條基因片段與T載體連接后進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果顯示，8條目的片段與GenBank上公布的TMUV基因組序列相符。Race試劑盒擴(kuò)增結(jié)果結(jié)果進(jìn)行測序，與8條目的片段測序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，拼接后的基因序列全長為10 990 bp。

2.4 序列分析

病毒測序結(jié)果與GenBank上公布的不同時間分離自不同地區(qū)、不同宿主的TMUV全基因序列進(jìn)行比對，MEGA5軟件對這17條TMUV全基因序列的ORF進(jìn)行分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。從進(jìn)化樹上可以看出,2010年—2016年間分離鑒定的TMUV可分為2個基因型，即基因Ⅰ和基因Ⅱ，基因Ⅰ型又形成2個分支，即亞型Ⅰa和亞型Ⅰb分支。從進(jìn)化樹上可以看出近年來在我國不同家禽中出現(xiàn)的TMUV主要集中分布在基因Ⅰ型分支上，而在基因Ⅰ型分支上，又集中分布在基因亞型Ⅰa型分支上。TMUV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的繪制，為生產(chǎn)實(shí)踐中TMUV新型弱毒或滅活疫苗的研發(fā)提供重要的理論依據(jù)。本研究中分離這種TMUV屬于基因Ⅰa，這與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的分析結(jié)果是一致的。

2.5 核苷酸同源性分析

對17條TMUV的全基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示，17條TMUV全基因序列核苷酸同源性在97.0%～99.8%之間(圖5)，同源性很高。尤其是TMUV-SDAG株與基因Ⅰa分支中TMUV核苷酸同源性更高，均在99.0%以上。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.TMUV目的片段1～8；N.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1-8.1-8 objective fragments of TMUV;N.Negative control

圖3 TMUV全基因RT-PCR擴(kuò)增

Fig.3 The amplification of TMUV genome by RT-PCR

圖4 TMUV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖5 核苷酸同源性分析結(jié)果

3 討論

1995年前后，我國河北省石家莊、邯鄲等地飼養(yǎng)的康貝爾鴨出現(xiàn)腹瀉、腿麻痹等癥狀，產(chǎn)蛋鴨生殖系統(tǒng)受損傷，溫立斌等[14]最終分離并鑒定該病的病原屬于黃病毒科，這是首次關(guān)于黃病毒感染鴨群的報道。國外最早報道TMUV感染家禽是2000年左右，從馬來西亞發(fā)生肉雞癱瘓的病例中分離到了一株TMUV，將其命名為實(shí)兆遠(yuǎn)病毒(Sitiawan virus，SV)，這是首次確定TMUV對禽類有致病性[15]。2010年，我國南方部分養(yǎng)鴨地區(qū)出現(xiàn)了TMUV感染鴨群的疫情[4-5]，很快波及到我國絕大多數(shù)養(yǎng)鴨地區(qū)，傳播速度快，傳播范圍廣，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大危害。

近年來，由于TMUV疫苗及防控措施在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，水禽感染TMUV的幾率有所降低，但與其他病原體混合感染的情況卻不斷增多。本研究從山東某發(fā)病肉鴨場分離到一株TMUV，并對其進(jìn)行了鑒定。該病毒能在雞胚和鴨胚中增殖，隨著病毒在胚體中傳代次數(shù)的增加，TMUV對雞胚和鴨胚的致死能力趨于穩(wěn)定，一般集中在3 d～4 d死亡，這與葛平萍等[16]的報道是一致的。

本研究對分離的病毒進(jìn)行了全基因序列的測定，與GenBank中公布的多株不同時間分離自不同地點(diǎn)和宿主的TMUV ORF基因序列進(jìn)行了核苷酸并對，通過MEGA5和DNA Star軟件進(jìn)行分析，并繪制了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由于2010年以前分離鑒定的TMUV均沒有在GenBank中上傳其全基因序列，因此本研究中采用的TMUV全基因序列均為2010年后上傳的。序列比對結(jié)果顯示，從2010年—2016年出現(xiàn)的TMUV主要進(jìn)化成了2個分支，其中分支1又進(jìn)化出2個小分支。2010年—2016年中出現(xiàn)的TMUV主要屬于分支Ⅰa，而分支Ⅱ和Ⅰb主要是2010年—2011年出現(xiàn)的TMUV分離株，之后出現(xiàn)的分離株主要是Ⅰa分支中，由此可見，Ⅰa分支可能是TMUV主要進(jìn)化趨勢，而分支Ⅱ和Ⅰb可能會隨著病毒的不斷變異進(jìn)化而逐漸消失，這與李澤君等[17]對2010年—2013年中TMUV分離株ORF序列比對分析的結(jié)果是一致。本研究中分離鑒定的TMUV屬于分支Ⅰa，這也與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中顯示的結(jié)果是一致的。

通過對TMUV核苷酸同源性進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，本研究分離鑒定的TMUV-SDSG分離株與GenBank公布的分離自2010年—2015年間的16株TMUV全基因序列同源性很高，而且來自不同分離時間、地區(qū)和宿主的TMUV核苷酸同源性也很高，均在97%以上。尤其是TMUV-SDSG分離株與進(jìn)化樹中基因Ⅰa型中TMUV核苷酸的同源性更高，均在99.0%以上。

本研究分離并鑒定了一株TMUV分離株，該病毒屬于基因Ⅰa型，屬于近年來TMUV流行主要基因型分支，且與GenBank中公布的其他TMUV核苷酸同源性很高。可見，TMUV-SDSG分離株是近年來TMUV流行的優(yōu)勢毒株，這為TMUV新型弱毒或滅活疫苗的篩選制備及該病毒分子流行病學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)，并提供重要的依據(jù)。

[1] Bowen E T，Simpson D I，Platt G S,et al.Arbovirus infections in Sarawak, October 1968-February 1970:human serological studies in a land Dyak village[J].Trans Royal Soc Trop Med Hyg,1975,69(2):182-186.

[2] Karabatsos N.Supplement to international catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates[J].Am J Trop Med Hyg,1978,27:372-440.

[3] Olson J G,Ksiazek T G,Gubler D J,et al.A survey for arboviral antibodies in sera of humans and animals in Lombok,Republic of Indonesia[J].Ann Trop Med Parasitol,1983,77:131-137.

[4] Cao Z Z,Zhang C,Liu Y H,et al.Tembusu virus in ducks,China[J].Emerg Infect Dis,2011,17:1873-1875.

[5] Su J L,Li S,Hu X D,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu-related flavivirus[J].PLoS One,2011,6:e18106.

[6] Tang Y,Diao Y X,Gao X H,et al.Analysis of the complete genome of Tembusu virus,a flavivirus isolated from ducks in China[J].Transbound Emerg Dis,2012,59:336-343.

[7] Yun T,Zhang D B,Ma X J,et al.Complete genome sequence of a novel flavivirus,duck tembusu virus,isolated from ducks and geese in china[J].J Virol,2012,86:3406-3407.

[8] Li S,Li X X,Zhang L J,et al.Duck Tembusu virus exhibits neurovirulence in BALB/c mice[J].Virol J,2013,10(1):260.

[9] Liu M,Chen S Y,Chen Y H,et al.Adapted Tembusu-like virus in chickens and geese in China[J].J Clin Microbiol,2013,50:2807-2809.

[10] Tang Y,Diao Y X,Chen H,et al.Isolation and genetic characterization of a tembusu virus strain isolated from mosquitoes in Shandong,China[J].Transb Emerg Dis,2013,62(2):209-216.

[11] Liu Z L,Ji Y H,Huang X H,et al.An adapted duck Tembusu virus induces systemic infection and mediates antibody-dependent disease severity in mice[J]. Virus Res,2013,176:216-222.

[12] Zhang Y,Li X L,Chen H,et al.Evidence of possible vertical transmission of Tembusu virus in ducks[J].Vet Microbiol,2015,179:149-154.

[13] 王 鈺，王經(jīng)滿，曹瑞兵.鴨坦布蘇病毒XZ-2012株的分離鑒定與基因變異分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，38(3):446-452.

[14] 溫立斌，張福軍，王玉然，等.鴨病毒性腦炎(暫定)病原分離與鑒定的初步研究[J].中國獸醫(yī)雜志,2001,37(2):3-4.

[15] Kono Y，Tsukamoto K，Abd H M,et al.Encephalitis and retarded growth of chicks caused by Sitiawan virus,a new iso-late belonging to the genus Flavivirus[J].Am J Trop Med Hyg,2000,63(1-2):94-101.

[16] 葛平萍，刁有祥，唐 熠，等.鴨坦布蘇病毒山東株的分離鑒定及其特性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2014,34(1):30-33.

[17] Dai L,Li Z J, Tao P.Evolutionary analysis of Tembusu virus:Evidence for the emergence of a dominant genotype[J].Infect Genet Evol,2015,32:124-129.

IsolationandGenomicSequenceAnalysisofDuckTembusuVirus

TI Jin-feng,LI Zhi-jie,LI Fang

(ShandongVocationalAnimalScienceandVeterinaryCollege,Shandong,Weifang,261061,China)

Cherry valley ducks at 21 days old got sick suddenly in Shandong Weifang and the ill ducks expressed neurological symptoms of paralysis,yellow-green or yellowish-white loose stool,and mortality about 5%.In order to determine the pathogen of sick ducks,firstly dead duck livers were collected and used to isolate and identify the pathogen through 9-11 day-old SPF chicken embryoes.Secondly the whole genome of virus was amplified by RT-PCR and sequenced.The phylogenetic tree was drawn by MEGA5 software and the nucleotide homology analysis was carried out by DNA Star software.The result showed that one Tembusu virus (TMUV) strain was isolated by SPF chicken embryo and was named TMUV-SDSG.The whole genome is 10 990 nt and encodes a polyprotein containing 3 426 amino acids.The analysis of phylogenetic tree showed that the TMUV-SDAG strain belongs to Ⅰa branch.The nucleotide homology analysis results showed that the nucleotide homology is as high as 97.0%-99.8% among the TMUV-SDSG strain and 16 TMUV isolates in GenBank.A TMUV strain was isolated successfully and analyzed which laid the foundation for screening and preparation of attenuated and inactivated vaccines and molecular epidemiological study.

duck Tembusu virus; nucleotide homology analysis; polyprotein

2017-02-17

山東省高等學(xué)?？萍及l(fā)展計劃項目(J16LF58)；濰坊市科技發(fā)展計劃項目(2013YD139，20121366)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(SDAIT-13-011-05)

提金鳳(1977-)，女，山東萊州人，講師，博士，主要從事家禽病毒性傳染病研究。

S852.659.6;S858.32

:B

:1007-5038(2017)09-0128-06