劉東旭，李虹瑾，尹柏雙，沙萬(wàn)里，付連軍，李國(guó)江*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130033； 3.吉林省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132101)

乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)斷奶仔豬腹瀉的作用

劉東旭1，3，李虹瑾2，3，尹柏雙1，3，沙萬(wàn)里1，3，付連軍1，3，李國(guó)江1，3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130033； 3.吉林省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林 132101)

為了探究乳酸菌素與包膜丁酸鈉共添加對(duì)仔豬腸道菌群、生產(chǎn)性能、腸道結(jié)構(gòu)及腹瀉情況的影響,將90頭體重7.53 kg±0.49 kg的28日齡斷奶仔豬隨機(jī)分為3組,A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；B組為乳酸菌素組，飼喂基礎(chǔ)日糧+1.5 g/kg乳酸菌素；C組為共添加組，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.3 g/kg包膜丁酸鈉&1.5 g/kg乳酸菌素，試驗(yàn)期28 d。試驗(yàn)期間，檢測(cè)斷奶仔豬腸道中菌群種類及數(shù)量的變化，同時(shí)監(jiān)測(cè)并記錄各試驗(yàn)組仔豬的日采食量、日增重及仔豬的腹瀉情況。結(jié)果顯示,試驗(yàn)組仔豬腸道有害菌的含量與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)；兩個(gè)試驗(yàn)組的平均日增重顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且呈現(xiàn)共添加組>乳酸菌素組>對(duì)照組的趨勢(shì)；并且乳酸菌素組、共添組的料肉比均低于對(duì)照組且差異顯著(P<0.05)。仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加乳酸菌素和包膜丁酸鈉后，腹瀉率與腹瀉指數(shù)分別降低42.72%與46.15%。觀察試驗(yàn)后仔豬腸道形態(tài)，發(fā)現(xiàn)共添加組仔豬腸道形態(tài)更為完整，絨毛更長(zhǎng)更粗壯。表明仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加乳酸菌素與包膜丁酸鈉，能夠顯著提高仔豬的生產(chǎn)性能，保護(hù)腸道益生菌的含量，維持腸道完整形態(tài)，并降低仔豬腹瀉率。

仔豬；乳酸菌素；包膜丁酸鈉；生產(chǎn)性能；腹瀉

斷奶是仔豬生長(zhǎng)發(fā)育的重要過(guò)程[1]，由于從母乳喂養(yǎng)到采食飼料的飲食結(jié)構(gòu)變化，斷奶常常會(huì)對(duì)仔豬產(chǎn)生諸多影響。斷奶初期仔豬很少釆食或不采食，一方面可能是由于胃腸道酸度降低，不能激活酶原，另一方面由于消化器官酶的合成和分泌受到影響所致[2-3]。同時(shí)斷奶使得仔豬胃腸道內(nèi)pH升高，飼料中的大腸埃希菌等細(xì)菌易通過(guò)胃而進(jìn)入腸道且大量繁殖，大腸中的病原菌也容易逆行至小腸并大量增殖，乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的增殖減少，微生物區(qū)系平衡失調(diào)，有益菌失去了在腸壁上的占位優(yōu)勢(shì)，過(guò)多的有害菌附著在腸壁上并釋放毒素，穿透腸壁，引起一系列化學(xué)反應(yīng)，損傷腸道，引起消化功能紊亂，免疫機(jī)能下降，易造成仔豬腹瀉，營(yíng)養(yǎng)吸收不足，生長(zhǎng)受到抑制[4-5]。并且，現(xiàn)階段豬場(chǎng)常用抗菌藥物來(lái)預(yù)防和治療仔豬腹瀉。抗菌藥物在殺滅腸道有害菌的同時(shí)，也殺滅了有益菌，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，造成抗菌藥物性腹瀉[6]。為此，本試驗(yàn)在仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加包膜丁酸鈉及乳酸菌素，通過(guò)檢測(cè)斷奶仔豬腸道中菌群種類及數(shù)量的變化，并記錄各試驗(yàn)組仔豬的日采食量、日增重及仔豬的腸道結(jié)構(gòu)和腹瀉情況。探索包膜丁酸鈉和乳酸菌素對(duì)仔豬腸道菌群、生產(chǎn)性能、腸道結(jié)構(gòu)及腹瀉情況的影響。為研究防治斷奶仔豬腹瀉，提高仔豬生產(chǎn)性能，構(gòu)建減少仔豬抗菌藥物使用的健康養(yǎng)殖方法，提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

需氧菌培養(yǎng)基：伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMb)、SS瓊脂(SS)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、EC肉湯培養(yǎng)基(Ec)，厭氧菌培養(yǎng)基：雙歧桿菌培養(yǎng)基、PMS培養(yǎng)基(PMs)、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(LBs)、BDS培養(yǎng)基(BDs)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；多黏菌素B溶液、新生霉素，青島尼賽欣合生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；生化鑒定瓶，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及日糧配方 將體重相近(7.53 kg±0.49 kg)的90頭28日齡的長(zhǎng)×大二元雜交斷奶仔豬(已閹割)，隨機(jī)分為3組：A、B、C組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭。A組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；B組為乳酸菌素組，飼喂基礎(chǔ)日糧+1.5 g/kg乳酸菌素；C組為共添加組，飼喂基礎(chǔ)日糧+0.3 g/kg包膜丁酸鈉和1.5 g/kg乳酸菌素。試驗(yàn)期28 d?；A(chǔ)日糧配方見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)仔豬在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院畜牧場(chǎng)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過(guò)程嚴(yán)格按照豬場(chǎng)管理規(guī)范進(jìn)行，并按正常程序進(jìn)行免疫預(yù)防接種和驅(qū)蟲(chóng)。

1.2.3 細(xì)菌分離鑒定 試驗(yàn)最后1天，無(wú)菌手術(shù)收集各組仔豬腸道內(nèi)容物1 g，并溶于1 mL PBS中，取50 μL腸道內(nèi)容物進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7。根據(jù)各培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)制備相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基。將稀釋好的細(xì)菌涂布至選擇培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)。按選擇培養(yǎng)基及接種對(duì)象不同，作需氧或厭氧培養(yǎng)，以分離培養(yǎng)出腸道中相應(yīng)菌種(表2)。各腸道菌群數(shù)量采用平板菌落計(jì)數(shù)方法，將計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/g)取對(duì)數(shù)記錄。1 g樣品中細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算公式為：細(xì)菌數(shù)=記錄數(shù)×稀釋倍數(shù)×1 000/50。對(duì)選擇培養(yǎng)基中的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，并對(duì)分離出來(lái)的細(xì)菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定。

表2 菌屬的培養(yǎng)方法

1.2.4 生長(zhǎng)指標(biāo)及腹瀉率的測(cè)定 每天記錄并計(jì)算各組的采食量、日均采食量，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算料肉比。每天早晨8:00，稱量空腹仔豬重量并記錄，根據(jù)每日體重計(jì)算平均日增重。同時(shí)觀察仔豬糞便形態(tài)、顏色，記錄腹瀉頭數(shù)及腹瀉情況，計(jì)算腹瀉率。腹瀉率(%)=總腹瀉次數(shù)/(總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100%；腹瀉指數(shù)=糞便評(píng)分之和/供試豬總頭數(shù)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3，該指數(shù)越高，表示腹瀉越嚴(yán)重。

1.2.5 腸組織切片制作 試驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)無(wú)菌手術(shù)截取5頭仔豬腸組織1 cm～2 cm，放置于100 g/L的甲醛溶液中固定12 h～14 h后,持續(xù)水洗24 h。組織樣本經(jīng)梯度酒精脫水后，二甲苯中透明20 min。將透明的腸組織樣本浸蠟、包埋、冷凍后，對(duì)仔豬腸道組織進(jìn)行切片。應(yīng)用蘇木精及伊紅溶液對(duì)組織切片進(jìn)行染色[7]。光學(xué)顯微鏡下，記錄組織形態(tài)并拍攝組織照片。

表3 腹瀉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Graph Pad Prism軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)t檢驗(yàn)確定試驗(yàn)數(shù)據(jù)是否具有統(tǒng)計(jì)意義。P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 仔豬腸道菌群的分離及鑒定

對(duì)試驗(yàn)后，無(wú)菌手術(shù)采集的腸道內(nèi)容物梯度稀釋液選擇培養(yǎng)結(jié)果顯示，選擇培養(yǎng)基篩選出的主要腸道細(xì)菌有乳桿菌、雙歧桿菌、葡萄球菌、大腸埃希菌、腸球菌等(圖1)。各組取樣獲得的腸道內(nèi)容物經(jīng)處理后，對(duì)仔豬腸道中細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加乳酸菌素及包膜丁酸鈉能夠明顯上調(diào)腸道中有益菌——雙歧桿菌的數(shù)量(P<0.05)，降低腸道中有害菌——大腸埃希菌、腸球菌及金黃色葡萄球菌的數(shù)量(P<0.05)(表4)。

A.乳桿菌；B.雙歧桿菌；C.大腸埃希菌；D.腸球菌；E.金黃色葡萄球菌

A.Lactobacillus；B.Bifidobacterium；C.Escherichiacoli；D.Enterococcus；E.Staphylococcusaureus

圖1斷奶仔豬腸道分離菌革蘭染色結(jié)果

Fig.1 Gram staining results of bacteria isolated from intestine of weaned piglets

表4 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)仔豬腸道主要菌群的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 乳酸菌素及包膜丁酸鈉對(duì)仔豬生產(chǎn)性能影響

對(duì)試驗(yàn)用斷奶仔豬進(jìn)行生產(chǎn)性能指標(biāo)監(jiān)測(cè)，并計(jì)算仔豬平均日增重、平均日采食量及料肉比，結(jié)果如表5所示。從表5可知，試驗(yàn)開(kāi)始前，仔豬的初始體重沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，而隨著試驗(yàn)結(jié)束，統(tǒng)計(jì)分析仔豬生產(chǎn)性能發(fā)現(xiàn)，2個(gè)組試驗(yàn)組的平均日增重顯著高于對(duì)照組，且呈現(xiàn)共添加組>乳酸菌素組>對(duì)照組的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，乳酸菌素組和共添加組平均日增重分別提高4.89%及8.99%，差異顯著(P<0.05)。計(jì)算各組料肉比，對(duì)照組的料肉比為1.81，乳酸菌素組、共添加組的料肉比分別為1.79和1.73。對(duì)比對(duì)照組，其料肉比分別降低了1.10%和4.42%，差異顯著(P<0.05)。

表5 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same rown(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.3 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)仔豬腹瀉率及腹瀉指數(shù)的影響

每天觀察并記錄各試驗(yàn)組斷奶仔豬腹瀉情況，計(jì)算各組斷奶仔豬腹瀉率與腹瀉指數(shù)，所得結(jié)果如表6所示。

根據(jù)表6分析可知，仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加乳酸菌素與包膜丁酸鈉后，腹瀉率與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。對(duì)比各組腹瀉指數(shù)及腹瀉率，乳酸菌素與包膜丁酸鈉共添加組對(duì)比對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，腹瀉率降低42.72%，腹瀉指數(shù)降低46.15%。

2.4 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，各組斷奶仔豬隨機(jī)選取5頭，無(wú)菌手術(shù)法截取腸組織，進(jìn)行腸道組織切片及HE染色，顯微鏡下觀察。對(duì)比對(duì)照組和乳酸菌素組，共添加組仔豬的小腸絨毛結(jié)構(gòu)更為完整、健康，絨毛更長(zhǎng)更粗壯(圖2)。

表6 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)斷奶仔豬腹瀉率及腹瀉指數(shù)的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

A.對(duì)照組;B.乳酸菌素組;C.共添加組

A.Control group;B.Lactic acid bacteria group;C.Co-addition group

圖2各組仔豬腸道絨毛組織切片結(jié)果(HE,400×)

Fig.2 The intestinal villus tissue results of different groups(HE,400×)

3 討論

3.1 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

乳酸菌素和丁酸均會(huì)降低腸道內(nèi)pH[8]。理論情況下，在酸性環(huán)境中，作為有益菌的乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)會(huì)勝過(guò)有害菌大腸埃希菌。但是本試驗(yàn)結(jié)果中顯示，在仔豬基礎(chǔ)日糧中單獨(dú)添加乳酸菌素后，雖然降低仔豬腸道中有害菌大腸埃希菌的含量，但是也同時(shí)降低腸道中乳桿菌的含量，這可能與乳酸菌素的特性有關(guān)，對(duì)于親緣關(guān)系較近的種屬具有抗菌生物活性。飼料中的乳酸菌素抑制了乳桿菌的生長(zhǎng)。同樣的原因，使得在仔豬飼料中同時(shí)添加乳酸菌素和包膜丁酸鈉后，即使包膜丁酸鈉可以增加有益菌群(乳桿菌)的含量，共添加組仔豬腸道中乳桿菌的含量只是與對(duì)照組相近。

3.2 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響

丁酸作為短鏈脂肪酸中的重要代表，是結(jié)腸細(xì)胞的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能為腸道上皮細(xì)胞提供能量，在調(diào)節(jié)胃腸機(jī)能、腸道微生態(tài)平衡、電解質(zhì)平衡和腸道pH有著重要作用[9-10]。而乳酸菌素也恰恰在腸道菌群調(diào)節(jié)上也有重要作用。對(duì)乳酸菌素進(jìn)行抑菌試驗(yàn)研究表明，乳酸菌素對(duì)如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀菌、銅綠假單胞菌、單核增生李斯特菌等動(dòng)物腸道的病原菌都有很好地抑制作用。因此，本試驗(yàn)在仔豬基礎(chǔ)日糧中同時(shí)添加乳酸菌素和包膜丁酸鈉后，仔豬腸道中有害菌——大腸埃希菌、腸球菌及金黃色葡萄球菌的含量顯著降低，并增加有益菌——雙岐桿菌的含量，維持乳桿菌水平，促進(jìn)仔豬健康腸道微生態(tài)環(huán)境的建立。對(duì)比本試驗(yàn)各組腹瀉指數(shù)及腹瀉率發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在仔豬基礎(chǔ)日糧中添加乳酸菌素和包膜丁酸鈉后可降低腹瀉率和腹瀉指數(shù)，且共添加組降低效果優(yōu)于單獨(dú)添加乳酸菌素組。表明乳酸菌素與包膜丁酸鈉共添加在降低仔豬腹瀉指數(shù)上有良好效果，且二者之間有協(xié)同作用，共同添加效果比單一添加乳酸菌素效果大幅提升。

3.3 乳酸菌素聯(lián)合包膜丁酸鈉對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)及生長(zhǎng)性能的影響

生產(chǎn)性能是反映仔豬營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)最直接的指標(biāo)。在斷奶仔豬飼料中分別添加1.5 g/kg的乳酸菌素、0.3 g/kg包膜丁酸鈉1.5 g/kg乳酸菌素后，與對(duì)照組相比，斷奶仔豬的日增重及料肉比的降低，呈現(xiàn)共添加組>乳酸菌素組>對(duì)照組的趨勢(shì)。提示乳酸菌素及包膜丁酸鈉共同作用能夠增加仔豬的生長(zhǎng)性能。這可能與乳酸菌素及包膜丁酸鈉的獨(dú)特作用機(jī)制有關(guān)。有文獻(xiàn)指出，乳酸菌素能夠促進(jìn)胃液的分泌，增強(qiáng)胃腸的消化蠕動(dòng)，使食物更好地消化吸收，而包膜丁酸鈉獨(dú)特的乳臭味，具有強(qiáng)烈的誘食性[11]，因此，二者共同作用能夠大幅提升仔豬對(duì)飼料的采食量，并且包膜丁酸鈉能直接為腸上皮細(xì)胞提供能量，以誘導(dǎo)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的分化增殖和成熟，而小腸黏膜上皮細(xì)胞是執(zhí)行消化吸收功能的最主要細(xì)胞。因此，在仔豬飼料中同時(shí)添加乳酸菌素和包膜丁酸鈉，能夠促進(jìn)仔豬對(duì)飼料的轉(zhuǎn)化率，提高仔豬的生產(chǎn)性能。同時(shí)，包膜丁酸鈉也能促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，抑制腸道炎癥反應(yīng)，能夠幫助維持腸道結(jié)構(gòu)和形態(tài)的完整，促進(jìn)腸絨毛及隱窩組織的發(fā)育。因此，在本次試驗(yàn)中，乳酸菌素和包膜丁酸鈉共添加組的小腸絨毛結(jié)構(gòu)更為完整，絨毛長(zhǎng)而粗壯，絨毛呈圓柱狀。而對(duì)照組和乳酸菌素組中，腸組織無(wú)明顯差異，小腸絨毛均呈平舌狀，絨毛稀疏。說(shuō)明包膜丁酸鈉能夠幫助仔豬維持腸道完整形態(tài)，促進(jìn)小腸絨毛發(fā)育，從而維持腸道健康，而乳酸菌素對(duì)仔豬腸道結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。

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EffectofLacticacidbacteriaCombinedwithCoatedSodiumButyrateonDiarrheaofWeanedPiglets

LIU Dong-xu1，3, LI Hong-jin2，3, YIN Bai-shuang1，3, SHA Wan-li1，3, FU Lian-jun1，3, LI Guo-jiang1，3

(1.JilinAgriculturalScienceandTechnologyUniversity,Jilin,Jilin,132101,China;2.JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130033,China；3.KeyLabofPreventiveVeterinaryMedicineinJilinProvince,Jilin,Jilin,132101,China)

In order to explore the effects of lactic acid bacteria,and coated sodium butyrate on intestinal flora,production performance,intestinal structure and diarrhea of piglets,90 weaned piglets with similar weight were randomly divided into 3 groups:group A control group,the weaned piglets were fed with basal diet;B lactic acid bacteria group,the weaned piglets were fed with basal diet +1.5 g/kg lactic acid bacteria;C co-addition group,the weaned piglets were fed with basal diet +1.5 g/kg lactic acid bacteria & 0.3 g/kg coated sodium butyrate.The experimental period was 28 days.During the experiment,the changes of the type and quantity of the intestinal flora in the weaned piglets were detected,and the daily feed intake,daily gain and diarrhea were recorded.The results showed that the contents of harmful bacteria in intestinal tract of experimental group were significantly lower than that of control group (P<0.05).The average daily gains of the two experimental groups ware significantly higher than that of the control group (P<0.05),and showed a trend of co-addition group> lactic acid bacteria group>control group;and the feed/meat ratio of lactic acid bacteria group and co-additive group was lower than that of control group (P<0.05).Diarrhea rate and diarrhea index decreased by 42.72% and 46.15% respectively after adding both lactic acid bacteria and coated sodium butyrate in piglet diets.The intestine morphology of the piglets was observed and found that the intestine morphology of piglets was more complete and the villi were longer and thicker.The results showed that lactic acid bacteria and coated sodium butyrate could significantly improve the production performance of piglets,protect the content of probiotics,maintain intestine integrity and reduce the diarrhea rate of piglets.

piglets;lactic acid bacteria;coated sodium butyrate;production performance;piglet diarrhea

2017-02-15

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015380)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150623004TC)

劉東旭(1985-)，女，吉林吉林人，講師，博士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。*

S858.28;859.794

:A

:1007-5038(2017)09-0084-06