吳海濱，楊 娟，周杰瓏，劉安榮，楊 超，吳培福*

(1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明 650224；2.昆明動物園，云南昆明 650224)

獸醫(yī)臨床

昆明動物園孔雀源大腸埃希菌毒力基因及耐藥基因檢測

吳海濱1△，楊 娟1△，周杰瓏1，劉安榮2，楊 超1，吳培福1*

(1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明 650224；2.昆明動物園，云南昆明 650224)

為研究孔雀源大腸埃希菌毒力基因和耐藥基因的流行特征，從昆明動物園采集孔雀糞樣，從中分離鑒定大腸埃希菌，并對12種毒力基因及22種耐藥基因進行檢測。結(jié)果表明，從孔雀糞樣中共分離鑒定出38株大腸埃希菌，分離菌traT基因攜帶率為100%；tsh基因攜帶率最低，為2.63%。未檢出氨基糖苷類藥物的耐藥基因aac(3)-Ia、β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥基因OXA、SHV，其余耐藥基因均呈陽性，其中磺胺類耐藥基因陽性率為7.89%～34.21%，四環(huán)素耐藥基因陽性率為50%～57.89%，氨基糖苷類耐藥基因陽性率為10.53%～50%，氯霉素類耐藥基因陽性率為42.11%～71.05%，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因陽性率為42.11%～63.16%，喹諾酮類耐藥基因陽性率為13.16%～68.42%。研究結(jié)果可為孔雀大腸桿菌病的預(yù)防提供理論支持和實踐借鑒。

孔雀；大腸埃希菌；毒力基因；耐藥基因

孔雀不僅可供觀賞，經(jīng)過人們的開發(fā)后，在保健、食用領(lǐng)域都有廣泛的利用，與人們關(guān)系密切。隨著孔雀養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，孔雀大腸桿菌病的流行日趨嚴重。由于大腸埃希菌(Escherichiacoli)血清型眾多[1]，極易產(chǎn)生耐藥性，使大腸桿菌病的防治越來越困難，經(jīng)常會給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟損失。因此，本研究在分離鑒定孔雀糞便大腸埃希菌的基礎(chǔ)上，對分離株毒力基因的流行病學特征及耐藥基因攜帶率進行研究，可為孔雀大腸桿菌病的防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

孔雀糞樣，2016年7月采集于昆明動物園，共38個糞樣；伊紅美藍培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉，昆明碩陽科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生化試驗 利用微生物的生化特性鑒定大腸埃希菌。生化試驗包括：糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖)、明膠液化試驗、硫化氫試驗、吲哚(靛基質(zhì))試驗、甲基紅(MR)試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、尿酶試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗。

1.2.2 大腸埃希菌PCR鑒定

1.2.2.1 DNA提取 PCR鑒定(Uid和16 S rRNA基因)所用引物參見文獻[2-3]。通過煮沸法提取大腸埃希菌基因組DNA，取分離株純培養(yǎng)物經(jīng)10 000 r/min 4℃離心5 min；棄上清液，用200 μL ddH2O使菌體懸??；于100℃水浴12 min，立即放置到冰浴中冷卻12 min，然后10 000 r/min 4℃離心5 min，取上清作為DNA模板，并對12種毒力基因及22種耐藥基因攜帶情況進行PCR檢測。12種毒力基因包括feoB、traT、fimA、fyuA、irp-2、iroN、iucC、tsh、iutA、iss、cvaC和papC，其擴增引物及參數(shù)參考文獻[4]；22種耐藥基因包括磺胺類耐藥基因(sul1、sul2、sul3)，四環(huán)素類耐藥基因(tetA、tetB)，氨基糖苷類耐藥基因(aacC2、aacC4、aadAl、aadA2、aac(3)-Ia、aac(3)-IIa、aph(3)-IIa)，氯霉素類耐藥基因(Catl、CmlA、Flor)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(CTX-M、SHV、OXA、TEM)，喹諾酮類基因Gyra(QRDR)、QnrS，其他基因Aac(6，)-Ib-cr。擴增引物及參數(shù)參考文獻[5]。引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2.2 分離株P(guān)CR鑒定 反應(yīng)采用25 μL體系，10×Reaction buffer 2.5 μL，10 μmol/L 上游引物2 μL，10 μmol/L下游引物2 μL，2.0 mmol/L dNTP 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，Template 2.5 μL，2.5 U/μLTaq0.25 μL，ddH2O 11.25 μL。PCR反應(yīng)的其他條件為：預(yù)變性94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 1 min，72℃ 45 s，共30個循環(huán)；最后72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 孔雀糞便中大腸埃希菌分離鑒定

本研究共分離到38株細菌，分離株在伊紅美藍培養(yǎng)基上為黑色帶金屬光澤的菌落；革蘭染色為陰性短桿菌，兩端鈍圓，長約1.5 μm～3.0 μm，多單個存在；生化鑒定特征符合大腸埃希菌的特性(表1)。分離株通過大腸埃希菌2種基因的PCR鑒定均為陽性，條帶大小與預(yù)計大小一致。最終鑒定大腸埃希菌38株。

2.2 大腸埃希菌毒力基因檢測

毒力基因檢測結(jié)果顯示(表2)，traT基因全部檢出；tsh基因檢出率最低，為2.63%，其中66.67%的毒力基因檢出率在50%以下。

2.3 大腸埃希菌毒力基因分布

從表3可以看出，38株大腸埃希菌中，攜帶至少1種毒力基因，最多攜帶8種。攜帶6種以上毒力基因的大腸埃希菌為34.21%。

表1 大腸埃希菌生化鑒定結(jié)果

注：⊕表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；+表示陽性；-表示陰性。

Note：⊕Means producing acid and gas;+Means positive;-Mean negative.

表2 大腸埃希菌毒力基因檢出率

表3 大腸埃希菌毒力基因分布

2.4 大腸埃希菌耐藥基因的檢測

采用已建立的PCR，對38株E.coli分離株進行22種耐藥基因的檢測(表4)。Catl檢出率最高(71.05%)；aac(3)-Ia、OXA和SHV基因均未檢出。在耐磺胺類藥物的基因中，sul3基因的檢出率最高(34.21%)；四環(huán)素類藥物以tetA基因的檢出率最高，為57.89%；氨基糖苷類以aph(3)-IIa基因的檢出率最高，為50.00%；β-內(nèi)酰胺類以CTX-M基因的檢出率最高，為63.16%；喹諾酮類以Gyra(QRDR)基因的檢出率最高，為68.42%。本研究中，分離株均攜帶3種以上耐藥基因，最大攜帶量為14種，37株攜帶耐藥基因在6種以上，占全部菌株的97.36%。

表4 大腸埃希菌耐藥基因的陽性率

3 討論

本試驗從孔雀糞便中分離鑒定38株大腸埃希菌，如果飼養(yǎng)不當、環(huán)境衛(wèi)生差等應(yīng)激因素下，可誘發(fā)大腸桿菌病。大腸桿菌病病死率高，對養(yǎng)殖帶來了嚴重的影響。研究發(fā)現(xiàn)，禽大腸埃希菌的致病力與其攜帶的毒力因子種類及數(shù)量密切相關(guān)，若大腸埃希菌攜帶毒力基因iroN、iss、tsh、cvaC、iutA、iucC，則可能是禽致病性大腸埃希菌，通常高致病性禽大腸埃希菌對上述基因攜帶率比較高[6-8]。為此，本研究對孔雀糞便中大腸埃希菌毒力基因進行了調(diào)查。與董向磊[4]、鐘杏好等[6]研究相比，本研究中毒力相關(guān)基因iroN、iss、tsh、cvaC、iutA、iucC檢出率較低，但少數(shù)菌株同時攜帶了較多與致病性密切相關(guān)的基因?？兹讣S便中大腸埃希菌的毒力基因攜帶率與大量文獻中雞源大腸埃希菌的毒力基因攜帶率相比普遍較低。

隨著大腸埃希菌耐藥譜越來越廣，大量傳統(tǒng)抗菌藥物已經(jīng)淘汰，研究其耐藥性變得尤為重要，大腸埃希菌耐藥性與其耐藥基因的攜帶率有明顯的相關(guān)性。為此，耐藥基因的檢測對孔雀大腸桿菌病臨床用藥有一定的指導意義。在陸倩倩等[1]、崔煥忠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，從2011年—2013年致病性孔雀大腸埃希菌對氯霉素類和四環(huán)素類藥物耐藥性增強。本研究發(fā)現(xiàn)，分離株對磺胺類耐藥基因和四環(huán)素類耐藥基因的攜帶率比2013年張忠[5]研究結(jié)果偏高,可能與磺胺類和四環(huán)素類藥物在孔雀養(yǎng)殖上的大量使用有關(guān)。此外，該動物園散養(yǎng)孔雀與人類接觸比較多，在環(huán)境衛(wèi)生與飼養(yǎng)方面應(yīng)該加強管理。

大腸埃希菌毒力基因和其致病性有很大關(guān)系，本次研究毒力基因檢出率較低，但少數(shù)分離菌攜帶了很多與致病性密切相關(guān)的基因，因此很可能由外界因素誘發(fā)大腸桿菌病。耐藥基因的檢測對孔雀大腸桿菌病臨床用藥有一定的指導意義。經(jīng)過對耐藥基因的調(diào)查，可以為孔雀大腸桿菌病的防治提供理論支持和實踐借鑒。

[1] 陸倩倩,彭欠欠,劉 陽,等.1株孔雀源大腸桿菌的分離與藥敏試驗[J].養(yǎng)禽與禽病防治,2013(5):41-42.

[2] 宋海霞.河南省雞腹瀉重要病原菌的分離鑒定與耐藥性及PCR檢測方法的研究[D].河南鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學,2010.

[3] 劉文強,賈玉萍,趙宏坤.16S rRNA在細菌分類鑒定研究中的應(yīng)用[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(11):15-18.

[4] 董向磊.禽致病性大腸桿菌的分離鑒定和分離株毒力基因與致病性相關(guān)性研究[D].江蘇揚州:揚州大學,2014.

[5] 張 忠.寧夏地區(qū)大腸桿菌臨床分離株的耐藥性研究[D].寧夏銀川:寧夏大學,2013.

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[9] 崔煥忠,周佰祥,張 輝,等.孔雀致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志,2011,47(10):33-34.

DetectionsofVirulenceGenesandDrugResistanceGenesofPeacockEscherichiacolifromKunmingZoo

WU Hai-bin1, YANG Juan1, ZHOU Jie-long1, LIU An-rong2, YANG Chao1, WU Pei-fu1

(1.CollegeofLifeScience,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan,650224,China;2.KunmingZoo,Kunming,Yunnan,650224,China)

In order to study the epidemic characteristics of peacockEscherichiacolivirulence genes and resistance genes,38 strains ofE.coliwere isolated and identified from fecal samples of peacocks in Kunming zoo.Moreover,12 kinds of virulence genes and 22 resistance genes were detected.The results showed that the traT gene carrying rate was 100%;the tsh gene carrying rate was the lowest,up to 2.63%.In terms of resistance genes,other resistance genes were detected except OXA and SHV coding for β-lactam and aac(3)-Ia drug resistance gene.The positive rate of sulfonamide resistantce genes was 7.89%-34.21%,the positive rate of tetracycline resistance genes was 50%-57.89%,the positive rate of the aminoglycoside resistance genes was 10.53%-50%,and the positive rate of chloramphenicol resistance genes for 42.11%-71.05%,the positive rate of β-lactam resistance genes 42.11%-63.16%,the positive rate of quinolone resistance genes 13.16%-68.42%.The results provided a theoretical support and practical reference for the prevention of theE.coliinfection.

peacock;E.coli; virulence gene; drug resistance gene

2016-09-05

西南林業(yè)大學科技創(chuàng)新基金(C15115)

吳海濱(1988-)，男，四川人，碩士研究生，主要從事動物疫源疫病研究?！魍蓉暙I作者。*

S858.93;S852.612

:B

:1007-5038(2017)09-0122-05