王帥兵，曲 斌，耿士偉，陸桂萍，蔣天梅，陳 蓉

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇南京 210036；3.中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 211198)

親水作用色譜-高分辨質(zhì)譜測定生鮮牛乳中7種氨基糖苷類藥物殘留

王帥兵1，曲 斌2*，耿士偉2，陸桂萍2，蔣天梅2，陳 蓉3

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇省畜產(chǎn)品質(zhì)量檢驗測試中心，江蘇南京 210036；3.中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇南京 211198)

建立了生鮮牛乳中鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素共7種氨基糖苷類抗生素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)100 mL/L三氯乙酸-乙腈提取和WCX固相萃取柱凈化后，采用親水作用色譜分離，四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測。對樣品前處理條件、液相色譜流動相及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，7種氨基糖苷類抗生素在20 μg/L～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，生鮮牛乳中的加標(biāo)回收率為88.7%～111.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%～13.1%，該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于生鮮牛乳中多種氨基糖苷類抗生素殘留的同時檢測。

氨基糖苷類；親水作用色譜-高分辨質(zhì)譜；生鮮牛乳

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides，AGs)是一類由1個或多個氨基糖分子與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素，極性大，呈堿性。AGs藥物對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有較強殺菌作用，在養(yǎng)殖過程中被廣泛用于預(yù)防和治療奶牛乳房炎[1]。然而，不合理用藥或不遵守休藥期規(guī)定濫用藥物常導(dǎo)致牛、羊等生鮮乳中出現(xiàn)AGs藥物殘留，長期飲用含AGs藥物殘留的乳制品可能對消費者產(chǎn)生耳毒性和腎毒性[2]。此外，AGs藥物殘留引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的問題也不容忽視[3]。因此，國內(nèi)外對生鮮乳及其他動物源性食品中AGs藥物殘留問題非常重視，歐盟、美國對動物性食品中AGs藥物殘留均有明確規(guī)定[4]，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定生鮮乳中AGs藥物的最高殘留限量(MRL)為100 μg/kg～500 μg/kg[5]。

目前，用于測定生鮮乳中AGs藥物殘留的方法主要有微生物分析法、免疫分析法和儀器分析法[2]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其定量準(zhǔn)確、靈敏度高成為檢測AGs藥物殘留的確證方法[6]。實際測定中因AGs藥物極性大，難以在反相色譜柱上保留，故當(dāng)前多通過向流動相中加入離子對試劑以增強色譜保留[7-8]。然而離子對試劑容易污染色譜柱，對pH也較敏感，影響試驗結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性。選用親水作用色譜柱(hydrophilic interaction chromatography,HILIC)則不同，在簡單的流動相組成條件下即可大大改善極性化合物的色譜行為，還可提高電噴霧離子化質(zhì)譜的靈敏度，十分適用于AGs藥物分析。本試驗根據(jù)AGs藥物的理化特點，通過改進(jìn)樣品前處理方法，選用HILIC色譜柱，優(yōu)化測定條件，建立一種高效、靈敏的AGs藥物多殘留檢測方法，可同時測定生鮮牛乳中7種AGs藥物殘留，為有效監(jiān)控該類藥物殘留提供基礎(chǔ)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 MS3基本型漩渦混勻器、KS501圓周振蕩搖床，德國IKA公司產(chǎn)品；Sigwa2K15高速冷凍離心機，Sigma公司產(chǎn)品；Oasis WCX固相萃取小柱(60mg/3mL)，Waters公司產(chǎn)品；N-EVAP 112型氮吹儀，美國Organomation 公司產(chǎn)品；Q Exactive Orbitrap LCMSMS四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，美國Thermo公司產(chǎn)品，配置電噴霧離子源；UltiMate 3000型超高效液相色譜儀，美國Thermo公司產(chǎn)品，配自動進(jìn)樣器和柱溫箱。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑 鏈霉素、雙氫鏈霉素、 慶大霉素、 妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素7種標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，含量為98%～99%；三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、氨水為分析純；乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；試驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 準(zhǔn)確稱取鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、安普霉素和阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用水溶解并定容至100 mL，混勻，即為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存于塑料瓶中，備用。

準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀釋定容，配制成1 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.2.2 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 精密稱取空白生鮮牛乳各2.00 g，置于50 mL聚丙烯塑料管中，分別加入中間標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL)0.04、0.1、0.2、0.4、1.00 mL，制成濃度相當(dāng)于20、50、100、200、500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2.00 g勻質(zhì)的生鮮牛乳樣品，置50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入100 mL/L三氯乙酸(含0.4 mmol/L EDTANa2)8 mL和乙腈2 mL，旋渦振蕩，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入500 mL/L氨水調(diào)節(jié)pH至8.5±0.5，再加正己烷2 mL振蕩，離心，下層水相轉(zhuǎn)移至另一塑料離心管中，備用。

取WCX固相萃取小柱，依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，將上述備用溶液上樣過柱，依次用1 mL/L氨水3 mL 、甲醇3 mL淋洗，用250 mL/L甲酸甲醇(V/V)6 mL洗脫，收集洗脫液，37℃氮氣吹干。加入1 mL乙腈-100 mmol/L甲酸銨(體積比為90∶10)溶液，充分渦旋使復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液上機待測。

1.2.4 測定條件 液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY CORTECS HILIC (2.1 mm×100 mm×1.7 μm,Waters公司)；柱溫25℃，進(jìn)樣量25 μL。流動相A為200 mmol/L甲酸銨水溶液(用甲酸調(diào)pH2.5)，B為含100 mmol/L甲酸銨的乙腈∶水(70∶30，V/V)溶液(用甲酸調(diào)pH4.0)，梯度洗脫程序如表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，霧化氣壓力為60.00 Psi(413.4 kPa)，離子噴霧電壓為4.0 kV，氣簾氣壓力為25.00 Psi(172.2 kPa)，離子化溫度為450℃，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式。優(yōu)化后確定的離子對和相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表2。

表2 7種氨基糖苷類抗生素質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 方法的選擇性

通過改善樣品前處理方法、優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，選擇豐度較強的二級碎片離子作為定量離子，確定7種藥物的特征離子對，同時檢測牛奶中7種AGs藥物，所有目標(biāo)藥物全部出峰且峰形對稱，7種AGs的MRM色譜圖如圖1。需說明的是，慶大霉素有兩個組分慶大霉素C1和C1a，兩組分有明顯不同的特征離子對并先后出峰。

2.2 方法的線性關(guān)系與定量限

將配制的濃度相當(dāng)于20、50、100、200、500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)樣測定。將各被測藥物的色譜峰面積與理論濃度采用一元二次回歸方程擬合，得到7種AGs藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表3，回歸曲線見圖2。所有藥物在20 μg/L～500 μg/L的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。被測藥物的定量限(LOQ)根據(jù)其響應(yīng)值大于等于基線響應(yīng)值的10倍(信噪比S/N≥10且準(zhǔn)確度和精密度(RSD)小于20%來確定。當(dāng)牛奶中7種AGs藥物的添加水平在20 μg/L時，其信噪比均大于10，表明本方法的LOQ可達(dá)20 μg/L。

A.鏈霉素；B.雙氫鏈霉素；C.慶大霉素C1；D.慶大霉素C1a； E.妥布霉素；F.卡那霉素；G.阿米卡星；H.安普霉素

表3 7種氨基糖苷類藥物的線性范圍和線性方程

2.3 方法的回收率和精密度

精密稱取空白生鮮牛乳2.00 g，分別添加低(50 μg/L)、中(100 μg/L)、高(200 μg/L)3個水平的7種氨基糖苷類藥物，按所建立的方法進(jìn)行樣品處理和測定，每個添加濃度做5個平行。平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(表4)。

a.鏈霉素；b.雙氫鏈霉素；c.慶大霉素C1；d.慶大霉素C1a； e.妥布霉素；f.卡那霉素；g.阿米卡星；h.安普霉素

2.4 實際樣品檢測

采用所建立的方法對實驗室留樣的50個生鮮牛乳樣品進(jìn)行檢測，未檢出氨基糖苷類藥物殘留。

3 討論

3.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

3.1.1 提取溶液的選擇 因生鮮牛乳中含大量蛋白質(zhì)及其他內(nèi)源性化合物，干擾目標(biāo)藥物的測定。因此，需沉淀蛋白質(zhì)，將藥物從基質(zhì)中分離出來。依據(jù)AGs藥物極性大，易溶于水的特性，可選用KHPO4緩沖液[9]、三氯醋酸( trichloroacetic acid,TCA)溶液[10]或乙酸銨緩沖液[11]等提取。因TCA溶液兼具提取和去蛋白效果，所以，本試驗中采用TCA溶液作為提取試劑，并比較了了50、100、200 mL/L 3種不同濃度TCA的提取效果。結(jié)果表明，隨著酸濃度提高，去蛋白效果也越好，但200 mL/L TCA提取不能使全部藥物出峰，可能因酸濃度過高產(chǎn)生離子抑制作用。因此，選擇100 mL/L TCA為主要提取溶液，通過試驗比較發(fā)現(xiàn)，向100 mL/L TCA中加入少量乙腈可以提高去蛋白效果。

3.1.2 固相萃取條件優(yōu)化 AGs藥物為強極性化合物，在弱堿性環(huán)境下以陽離子態(tài)存在。故本試驗中選擇弱陽離子交換小柱(WCX小柱)來凈化、富集樣品。按照WCX小柱提供商的方法依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，上樣后用50 mL/L氨水、甲醇各3 mL依次淋洗，最后用3 mL 50 mL/L甲酸甲醇洗脫，并不能將7種藥物全部洗脫下來。因此，通過改變淋洗液氨水的濃度、提高洗脫液中甲酸含量并增大洗脫液體積進(jìn)行選擇優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用1 mL/L氨水淋洗、250 mL/L甲酸甲醇6 mL洗脫可將7種藥物全部洗脫，且回收率高。同時比較了同一濃度甲酸甲醇與甲酸乙腈的洗脫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸甲醇比甲酸乙腈可獲得更高回收率，其原因在于甲醇的極性高于乙腈，故更易將極性大的AGs藥物洗脫下來。

表4 7種氨基糖苷類藥物的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

樣品溶液的pH影響AGs藥物的存在形式及其在固相萃取(SPE)小柱上的保留及分離，進(jìn)而影響回收率。試驗中考察了樣品在pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和10.5的回收率。結(jié)果表明，樣品溶液pH為8.0～8.5時，所有藥物的回收率最高。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 進(jìn)樣溶液組成 試驗中先后以水、含100 mmol/L甲酸銨的700 mL/L乙腈水(7∶3,V/V)溶液、含100 mmol/L甲酸銨的900 mL/L乙腈水(3∶1,V/V)溶液作為進(jìn)樣溶液進(jìn)行比較，結(jié)果表明以水為進(jìn)樣溶液7種AGs藥物在設(shè)定時間內(nèi)均未出峰，究其原因是樣品在HILIC色譜柱上的分離不是在親水環(huán)境下進(jìn)行，樣品中含水過多，被測藥物在固定相上的分配減弱，保留降低。100 mmol/L甲酸銨的乙腈水(V/V)溶液可使7種藥物全部出峰，但采用700 mL/L乙腈溶解樣品時色譜峰有一定拖尾現(xiàn)象，當(dāng)進(jìn)樣溶液中乙腈含量提高到900 mL/L時可明顯改善峰形，可能是進(jìn)樣液中有機相增強了藥物在固定相上的分配，從而提高了柱效。

3.2.2 流動相組成與pH 采用HILIC色譜柱分離時，流動相中有機相比例增加，被測藥物保留時間長。梯度洗脫時起始階段使用高比例有機相，可延長AGs藥在色譜柱上的保留，有利于基質(zhì)中雜質(zhì)與藥物的分離，后期逐漸提高水相比例，促進(jìn)AGs藥依次出峰。試驗中比較了甲醇-水、乙腈-水、流動相中添加甲酸銨對藥物在色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)以乙腈為有機相時各目標(biāo)物的響應(yīng)值和峰形均優(yōu)于甲醇，添加甲酸銨后可明顯提高藥物分離度，縮短保留時間。值得注意的是，因HILIC柱的固定相是親水的，工作時部分流動相是作為固定相的一部分來起作用的，因此，流動相中必須始終保持一定量的水。由于HILIC色譜柱在pH1.5～8作用穩(wěn)定，AGs在堿性條件下帶正電荷，故流動相中以甲酸銨為緩沖鹽時應(yīng)使pH2～5。因此最終確定200 mmol/L甲酸銨水溶液(用甲酸調(diào)pH2.5)、含100 mmol/L甲酸銨的乙腈∶水(70∶30，V/V)溶液(用甲酸調(diào)pH4.0)作為流動相。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含羥基及胺基，呈堿性，在質(zhì)譜上有很強的正離子響應(yīng)，故選擇正離子模式掃描。將100 μg/L單標(biāo)溶液進(jìn)樣分析，進(jìn)行母離子掃描，7種AGs藥物的一級質(zhì)譜圖中均出現(xiàn)豐度較高的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，故選擇準(zhǔn)分子離子峰作為母離子。分別對7種AGs藥物的母離子進(jìn)行轟擊碎裂，選擇豐度較強的二級碎片離子作為定量離子，確定7種藥物的特征離子對。最后優(yōu)化ESI源的碰撞電壓、離子化溫度、氣簾氣等參數(shù)，確定最佳質(zhì)譜條件。

本研究建立了采用親水作用色譜-高分辨質(zhì)譜法同時檢測生鮮牛乳中鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星和安普霉素共7種AGs藥物多殘留測定方法。該方法通過改善前處理方法，選用HILIC色譜柱提高AGs藥物的分離效果，定量準(zhǔn)確，LOQ低于國家對AGs規(guī)定的 MRL 100 μg/L，適用于實際樣品的檢測，可作為生鮮牛乳中AGs藥物殘留監(jiān)測的手段。

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DeterminationofSevenAminoglycosidesResiduesinRawCowMilkbyHILIC-HRMS

WANG Shuai-bing1,QU Bin2,GENG Shi-wei2,LU Gui-ping2,JIANG Tian-mei2,CHEN Rong3

(1.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege,Taizhou,Jiangsu,225300,China; 2.AnimalProductsQualityInspectionandTestCenterofJiangsuProvince,Nanjing,Jiangsu,210036,China; 3.CollegeofScience,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu,211198,China)

A ultra-high performance liquid chromatography-transdem mass spectrometry method was developed for the simultaneous determination of seven aminoglycosides residues including streptomycin,dihydrostrepmycin,gentamycin,tobramycin,kanamycin,amkacin and apramycin in raw cow milk.The samples were extracted with 100 mL/L trichloroacetic acid aqueous solution and acetonitrile,then the extracts were purified by a WCX cartridge.The seven aminoglycosides residues were seperated by hydrophilic interaction liquid chromatography and detected by high resolution mass spectrometry.The pretreatment condition of the sample,the HPLC condition and the MS operation parameters were optimized.The results showed that the lineareties of the seven aminlglycoside residues in 20 μg/L-500 μg/L had the correlation coefficient between 0.990 0-0.997 5.The recoveries raged from 88.7%-111.2% with the relative standard deviations of 6.3%-13.1%.The proposed method was successfully applied to the determination of the mass concentrations of the analytes in related samples,which provided a sensitive and quantitative method for the quality control of raw milk.This method is effective for the safety monitoring of aminoglycosides residues in raw milk.

aminoglycosides; hydrophilic interaction liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (HILIC-HRMS); raw cow milk

2016-10-11

王帥兵(1979-)，女，湖北黃梅人，講師，碩士，主要從事動物藥品分析與應(yīng)用相關(guān)的教學(xué)與科研工作。*

S859.84

:A

:1007-5038(2017)09-0067-06