潘曉婷，吳 秀，張哲珺，甘丹卉，蔣光愉

FISH檢測子宮頸石蠟組織切片與液基薄層細(xì)胞中hTERC基因的比較

潘曉婷，吳 秀，張哲珺，甘丹卉，蔣光愉

hTERC基因；FISH；石蠟包埋組織；蛋白酶K；液基薄層細(xì)胞；胃酶

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一，近幾年子宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升且發(fā)病年齡日趨年輕化[1]。在臨床工作中對(duì)子宮頸癌及癌前病變的篩查要求越來越高。目前各大醫(yī)院相繼開展FISH技術(shù)檢測子宮頸hTERC基因檢測應(yīng)用。同時(shí)已有很多子宮頸液基細(xì)胞涂片F(xiàn)ISH技術(shù)檢測的相關(guān)報(bào)道。而子宮頸石蠟包埋切片F(xiàn)ISH技術(shù)檢查子宮頸hTERC基因在臨床應(yīng)用比較少。本文針對(duì)子宮頸石蠟包埋組織切片和液基薄層細(xì)胞學(xué)(thinprep cytologic test, TCT)標(biāo)本用FISH技術(shù)檢查子宮頸hTERC基因?qū)嶒?yàn)操作進(jìn)行比較觀察。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集來自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科診斷為子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelical neoplasia, IN)1～3的子宮頸石蠟包埋組織50例和TCT標(biāo)本63例。分成兩組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別為石蠟組織樣本組和TCT樣本組。

1.2 主要試劑 胃蛋白酶，蛋白酶K，探針GLP TERC CSP3(探針由北京金菩嘉醫(yī)療公司提供)，2×SSC，乙醇。

1.3 主要儀器 OlympusBX51正置熒光顯微鏡，Dake原位雜交儀，德國耶拿CCD攝像頭，俄羅斯VIDEOTEST熒光原位雜交圖像分析軟件，電熱恒溫水箱。

1.4 方法 石蠟組織樣本組FISH實(shí)驗(yàn)操作過程：(1)樣本玻片制備：常規(guī)甲醛固定石蠟組織，3 μm厚切片，用硅膠涂膠玻片，65 ℃烤片2～3 h。這一處理使高溫變性玻片上組織的DNA不致掉片。(2)切片脫蠟：二甲苯5 min×3次，100%、95%、80%、70%梯度乙醇復(fù)水，去離子水沖洗。(3)酶消化：預(yù)處理微波用H檔5 min煮沸蒸餾水，再轉(zhuǎn)至ML檔將切片放置水中20 min。2×SSC漂洗5 min×2次。37 ℃蛋白酶K消化5～6 min，室溫下用2×SSC漂洗5 min×2次，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。(4)變性、雜交：由金菩嘉公司提供的探針，在避光環(huán)境中配置探針混合液，將混合液滴于雜交區(qū)域，封片。放置Dake原位雜交儀，83 ℃ 5 min變性，42 ℃ 16 h雜交。(5)洗滌：在溫度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1%NP-40 3 min，室溫下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI復(fù)染液，放置數(shù)分鐘后即可OlympusBX51正置熒光顯微鏡下觀察。

TCT樣本組FISH實(shí)驗(yàn)操作過程：(1)樣本玻片制備：取TCT檢查剩液約10 mL，1 200g離心10 min，1×PBS洗滌2遍后離心去除上清液；膠原酶B 5 mL(1 mg/mL)37 ℃水浴30 min，再次離心。加入5 mL去離子水，低滲重新吹打懸浮細(xì)胞。37 ℃水浴30 min，加2 mL固定液(甲醇 ∶冰乙酸=3 ∶1)預(yù)固定5 min。離心后棄上清液，再加5 mL固定液重復(fù)以上“固定、去除上清液的”步驟2次，用沉淀的細(xì)胞制備成一定濃度的溶液，將細(xì)胞滴于玻璃上，放置56 ℃ 烤片3 h老化細(xì)胞片。(2)酶消化：37 ℃胃蛋白酶消化30 s～20 min，室溫下用2×SSC 5 min、2次漂洗，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。(3)變性雜交：由金菩嘉公司提供的探針，在避光環(huán)境中配置探針混合液，將混合液滴于雜交區(qū)域，封片。放置Dake原位雜交儀，75 ℃ 5 min變性，42 ℃ 16 h雜交。(4)洗滌：在溫度46 ℃下玻片置于2×SSC 5 min，1% NP-40 3 min，室溫下70%乙醇3 min。玻片自然干燥后加DAPI復(fù)染液，放置數(shù)分鐘后即可OlympusBX51正置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 結(jié)果判定 (1)信號(hào)判斷：用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FITC/TRITC三單通濾光鏡觀察計(jì)數(shù)，采用Imstar-FISH 3.0軟件進(jìn)行圖像采集及處理。選擇熒光信號(hào)清晰細(xì)胞核形態(tài)完整的間期細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每例至少分析100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞比例。記錄紅色(hTERC)信號(hào)數(shù)和綠色(CSP3)信號(hào)數(shù)，正常細(xì)胞紅色信號(hào)和綠色信號(hào)各為2個(gè)，異常細(xì)胞為紅色信號(hào)≥3個(gè)，綠色信號(hào)≥2個(gè)細(xì)胞。(2)閾值建立：選用20例正常子宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行FISH檢測，每例至少分析100個(gè)細(xì)胞統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞比例。計(jì)算閾值=平均數(shù)(M)+3×標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，通過計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)采用有效陽性閾值=4.95%[2]。

1.6 結(jié)果判斷 每例樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)至少100個(gè)細(xì)胞，如果異常細(xì)胞比例大于陽性閾值則判斷有hTERC基因擴(kuò)增(FISH陽性，圖1、2)，如果異常細(xì)胞比例<4.95%則判斷無hTERC基因擴(kuò)增(FISH陰性，圖3、4)。

①②③④

圖1 石蠟組織樣本組：hTERC陽性，F(xiàn)ISH檢測顯示異常細(xì)胞紅色(hTERC)信號(hào)≥3個(gè)和綠色(CSP3)信號(hào)≥2個(gè) 圖2 液基薄層細(xì)胞樣本組：hTERC陽性，F(xiàn)ISH檢測顯示異常細(xì)胞紅色(hTERC)信號(hào)≥3個(gè)和綠色(CSP3)信號(hào)≥2個(gè) 圖3 石蠟組織樣本組：hTERC陰性，F(xiàn)ISH檢測顯示正常細(xì)胞紅色(hTERC)信號(hào)和綠色(CSP3)信號(hào)各為2個(gè) 圖4 液基薄層細(xì)胞樣本組：hTERC陰性，F(xiàn)ISH檢測顯示正常細(xì)胞紅色(hTERC)信號(hào)和綠色(CSP3)信號(hào)各為2個(gè)

2 結(jié)果

將石蠟組織樣本組和TCT樣本組在酶消化時(shí)間、背景干凈度、細(xì)胞數(shù)量滿意度、熒光信號(hào)滿意度、熒光信號(hào)雜交成功率等兩組數(shù)據(jù)相比，石蠟組織樣本組消化時(shí)間比較恒定，時(shí)間短，易掌控。而TCT樣本組酶消化時(shí)間有長有短，難掌控。因?yàn)榧?xì)胞受液基薄層細(xì)胞保存液固定和細(xì)胞在樣本制備過程中低滲處理細(xì)胞膨脹程度不同的影響。石蠟組織切片在處理后背景干凈度、細(xì)胞數(shù)量滿意度、熒光信號(hào)滿意度以及雜交成功率均較子宮頸脫落細(xì)胞制片高(表1)。

表1 石蠟組織切片與液基薄層細(xì)胞FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

3 討論

FISH是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA靶序列雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞和(或)組織原位觀察并分析細(xì)胞和內(nèi)雜交于DNA靶序列的多種彩色探針信號(hào)，以獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種基因狀態(tài)的信號(hào)。FISH技術(shù)近幾年廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)檢測，在檢測染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的畸變上非常有效。

FISH技術(shù)用于石蠟包埋組織檢測hTERC基因優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞數(shù)量足夠多，而且組織結(jié)構(gòu)清晰、集中，酶消化時(shí)間易掌控，處理后玻片背景干凈度，細(xì)胞數(shù)量滿意度，細(xì)胞形態(tài)，熒光信號(hào)滿意度以及雜交成功率均較子宮頸脫落細(xì)胞制片高，石蠟包埋組織檢測可在選片部位正確的基礎(chǔ)上避免血液、黏液的干擾[3]。

在臨床工作中，各級(jí)醫(yī)院病理醫(yī)師的制片、閱片水平存在一定差異，從而導(dǎo)致病理診斷結(jié)果存在一定主觀偏倚，而且有時(shí)CIN相鄰兩級(jí)之間很難區(qū)分。而FISH檢測石蠟組織切片，組織結(jié)構(gòu)完整清楚，子宮頸細(xì)胞易辨認(rèn)，而且對(duì)于CIN在相鄰兩級(jí)之間難以分級(jí)時(shí)通過FISH檢測可以選擇相應(yīng)區(qū)域的細(xì)胞閱片計(jì)數(shù)。因此用FISH技術(shù)檢查子宮頸組織hTERC基因可提高CIN病理分級(jí)的準(zhǔn)確性，對(duì)于臨床CIN的治療和隨訪有著更深厚的意義。

FISH技術(shù)用于子宮頸細(xì)胞懸液樣本檢測hTERC基因擴(kuò)增成功關(guān)鍵：(1)制備細(xì)胞片時(shí)，要注意包括樣本黏液、血液、炎細(xì)胞、細(xì)菌、雜質(zhì)、細(xì)胞在玻片分布均勻等方面的處理。子宮頸細(xì)胞懸液樣本檢測hTERC基因存在很多外在因素影響。例如上皮細(xì)胞量、血液、炎細(xì)胞、黏液、細(xì)菌、雜質(zhì)等均會(huì)影響雜交信號(hào)以及結(jié)果判讀。而且子宮頸脫落細(xì)胞易受生理周期及外界因素所影響，不同年齡婦女以及月經(jīng)周期中的不同時(shí)間子宮頸上皮厚薄以及脫落細(xì)胞的成分均有不同的變化，可能會(huì)影響到檢測的熒光信號(hào)及結(jié)果。因此每例患者的標(biāo)本均不一樣，對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測影響就會(huì)存在不同的差異。(2)樣本玻片預(yù)處理過程中胃蛋白酶消化時(shí)間的控制很重要，觀察玻片制備后標(biāo)本類型來控制玻片消化時(shí)間。標(biāo)本的類型包括有裸核的標(biāo)本和無裸核的標(biāo)本，有裸核的標(biāo)本細(xì)胞形態(tài)根據(jù)全裸核和部分裸核來調(diào)節(jié)消化時(shí)間，無裸核的標(biāo)本根據(jù)細(xì)胞質(zhì)厚薄，細(xì)胞核的大小來確定消化時(shí)間。(3)雜交熒光信號(hào)的觀察讀片：注意炎細(xì)胞和子宮頸細(xì)胞辨別，避開重疊細(xì)胞區(qū)，選擇細(xì)胞分布均勻的平坦區(qū)來計(jì)數(shù)。

FISH技術(shù)用于石蠟包埋組織檢測hTERC基因有兩方面的問題要注意：(1)切片本身的因素，即最初組織的處理，固定情況，石蠟包埋的過程以及樣本的年限、切片厚度等。因?yàn)榻M織類型、切片厚度、固定時(shí)間等均會(huì)使得理想的消化時(shí)間發(fā)生改變[4]。(2)石蠟包埋切片的處理因素，包括雜交前的酶消化、雜交后的洗滌等。因?yàn)殡s交前的酶消化是FISH檢測的關(guān)鍵步驟[5]，雜交后的洗滌溫度和pH值對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)弱有密切關(guān)聯(lián)。只要保持這兩方面的實(shí)驗(yàn)室條件穩(wěn)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)定性就很好，差異不大。在上前述因素中最關(guān)鍵最難把握就是酶消化環(huán)節(jié)，因此把握好雜交前酶消化處理環(huán)節(jié)，是獲取良好信號(hào)的前提。在石蠟包埋切片F(xiàn)ISH技術(shù)中，因?yàn)榻M織標(biāo)本之間的個(gè)體差異和每個(gè)實(shí)驗(yàn)室制片過程的差異，因此建議在不同的實(shí)驗(yàn)室甚至不同批次的樣本中在進(jìn)行FISH技術(shù)雜交檢測前，首先要對(duì)酶的消化時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。

本組實(shí)驗(yàn)存在不足，樣本例數(shù)少，如果有更大樣本量支持，結(jié)果將更有科學(xué)依據(jù)和臨床意義。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J,etal. Caneerstatisties,2010[J]. CA Caneer J Clin, 2010,60(5):277-300.

[2] 蔣光愉, 甘丹卉, 潘曉婷. hTERC基因檢測在宮頸上皮內(nèi)瘤變差異化治療的應(yīng)用[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,33(4):382-386.

[3] 伍軍平, 王建六, 羅 新. 如何利用TERC基因做好宮頸癌篩查分流及隨訪工作[J]. 中國計(jì)劃生育和婦產(chǎn)科, 2016,8(10):7-11.

[4] 陳 慧, 陳 淳, 王 華, 等. 利用相差顯微鏡觀察FISH檢測石蠟包埋切片的理想消化程度[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2013,29(7):809-810.

[5] 陳順平. FISH中酶消化細(xì)胞的幾點(diǎn)體會(huì)[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2010,26(1):116.

廣東省廣州市暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科 510630

潘曉婷，女，技師。E-mail: panxiaoting5701@126.com 蔣光愉，女，主任醫(yī)師，通訊作者。Tel: (020)38688436，E-mail: jianggy1107@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.030.html

R 394.2； R 737.33

B

1001-7399(2017)08-0937-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.030

接受日期：2017-04-14