袁 征，李 珍，孫彥珍

Uba-2在肝癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

袁 征，李 珍，孫彥珍

目的 探討Uba-2在肝癌組織中的差異表達(dá)以及過(guò)表達(dá)和低表達(dá)時(shí)其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法 qRT-PCR法檢測(cè)肝癌組織中Uba-2 mRNA的表達(dá)；將Uba-2的過(guò)表達(dá)載體和siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞HepG2后，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Uba-2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2中TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Uba-2在肝癌組織中呈高表達(dá)，與癌旁肝組織中的表達(dá)差異有顯著性(P<0.01)，qRT-PCR法檢測(cè)Uba-2在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或低表達(dá)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Uba-2表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力相關(guān)，siRNA干擾沉默HepG2細(xì)胞中Uba-2的表達(dá)會(huì)抑制其增殖生長(zhǎng)，細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Uba-2過(guò)表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，且與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western blot結(jié)果顯示Uba-2的異常表達(dá)影響TGF-β2及VEGF、Snail蛋白表達(dá)水平。結(jié)論 Uba-2基因在肝癌組織中的高表達(dá)可能具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

肝腫瘤；細(xì)胞增殖；侵襲轉(zhuǎn)移；Uba-2

肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，由于肝炎病毒感染漸為普遍，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率也逐年增加，且原發(fā)性肝癌無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，確診時(shí)多為中晚期[1]。類泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier, SUMO)是一種重要的蛋白翻譯后修飾形式，可調(diào)節(jié)靶蛋白的活性與功能。SUMO在轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及染色體分離等方面發(fā)揮重要作用[1-2]，其中SUMO-1是SUMO家族成員之一，SUMO-1可抑制p53基因的活性[3-4]，促使癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，而SUMO的激活需SUMO活化酶E1催化，E1是由Aos-1和Uba-2組成的異二聚體[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)Uba-2在甲狀腺嗜酸細(xì)胞腫瘤和人類前列腺癌等癌癥組織中出現(xiàn)異常表達(dá)，Uba-2基因的沉默會(huì)在一定程度上影響腫瘤細(xì)胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程。本課題組初步研究發(fā)現(xiàn)，Uba-2在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于非肝癌組織，而Aos-1的表達(dá)無(wú)明顯差異。為進(jìn)一步探討Uba-2與肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)Uba-2的過(guò)表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞株中細(xì)胞增殖以及侵襲能力的影響，探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 40例標(biāo)本來(lái)源于原發(fā)性肝癌患者，患者均簽署知情同意書且均未接受其他治療，包括30例男性和10例女性的肝癌組織及癌旁肝組織。肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。

1.2 儀器及試劑 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIzol(Invitrogen公司，USA)；PrimeScripts RT Reagent Kit(Takara公司，China)；Transwell Flters (8 μm；Millipore, USA)；RPMI 1640、Opti-MEMI培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco公司，USA)。定量PCR采用SYBR Green PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)；ABIPRISM 7500定量PCR儀；抗體為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。Uba-2過(guò)表達(dá)載體和siRNA干擾表達(dá)載體以及Uba-2引物由廣州銳博公司設(shè)計(jì)與合成。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(只有脂質(zhì)體)、Uba-2過(guò)表達(dá)組(Uba-2過(guò)表達(dá)載體和脂質(zhì)體)和Uba-2干擾表達(dá)組(加入U(xiǎn)ba-2 siRNA干擾表達(dá)載體100 nmol/L和脂質(zhì)體)。轉(zhuǎn)染成功后于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.4 Uba-2在肝癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá) 采用Trizol試劑提取肝癌組織中和各組細(xì)胞中的總RNA；采用PrimeScripts RT Reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Uba-2在組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平。每一樣品重復(fù)3次，以U6作為內(nèi)參，記錄Ct值。定量PCR反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min預(yù)變性(1個(gè)循環(huán))；95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。各組間Uba-2相對(duì)定量的倍數(shù)用2-△△Ct值表示。

1.5 Uba-2過(guò)表達(dá)或低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)：在0.2 mL臺(tái)盼藍(lán)(含0.1%Trypan Blue的PBS)中加0.2 mL細(xì)胞懸液，沒(méi)有活性的細(xì)胞被染成藍(lán)色；立即用微量巴氏吸管混勻后，吸足量細(xì)胞懸液從血細(xì)胞計(jì)數(shù)室的兩邊加樣；使用Freshney計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.6 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株遷徙能力 將轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞株分別培養(yǎng)于6孔板中直到板孔被細(xì)胞覆蓋，用200 μL移液器槍頭刮一個(gè)直徑約200 μm的垂直劃痕，PBS緩沖液沖洗3次，37 ℃孵育。24 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞平均遷徙距離，遷徙距離=總面積/高度，每組實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.7 Transwell法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株侵襲能力 按照Milipore公司Transwell小室說(shuō)明書操作，于100 μL基質(zhì)膠中以1 ∶8稀釋的無(wú)血清培養(yǎng)基中過(guò)夜孵育。常規(guī)培養(yǎng)12～16 h，3.7%甲醛固定細(xì)胞2 h，1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.8 Western blot法檢測(cè)TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞，制備細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)后按一定濃度進(jìn)行SDS-PAGE恒壓電泳。以GAPDH為內(nèi)參，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體為二抗，檢測(cè)TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 Uba-2在肝癌組織以及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá) Uba-2在肝癌組織中高表達(dá)，與癌旁肝組織中的表達(dá)相比差異有顯著性(P<0.01，圖1)；肝癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Uba-2過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)載體48 h后，qRT-PCR檢測(cè)出Uba-2過(guò)表達(dá)組在HepG2細(xì)胞株中呈高表達(dá)，Uba-2干擾表達(dá)組在細(xì)胞株中呈低表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比差異均有顯著性(P<0.01，圖2)。

圖1 Uba-2在肝癌和癌旁肝組織中的表達(dá)

圖2 Uba-2在肝癌細(xì)胞株HepG2中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)或低表達(dá)Uba-2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 由HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見，轉(zhuǎn)染72 h后，Uba-2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯促進(jìn)，而Uba-2干擾表達(dá)組受到明顯的抑制，在96 h兩組的作用效果最為明顯(圖3)。說(shuō)明Uba-2的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力相關(guān)，siRNA干擾沉默HepG2細(xì)胞中Uba-2的表達(dá)會(huì)抑制其增殖生長(zhǎng)。

2.3 過(guò)表達(dá)或低表達(dá)Uba-2對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Uba-2過(guò)表達(dá)組較陰性對(duì)照組細(xì)胞二維水平遷移速度明顯提高(P<0.05)，而Uba-2干擾表達(dá)組較陰性對(duì)照組細(xì)胞二維水平遷移速度明顯降低(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)為61.9±14.5，Uba-2過(guò)表達(dá)組的平均侵襲細(xì)胞數(shù)為99.2±10.2；較陰性對(duì)照組侵襲力上調(diào)，差異有顯著性(P<0.01)，Uba-2干擾表達(dá)組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)為36.5±6.7，較陰性對(duì)照組侵襲力下調(diào)，差異有顯著性(P<0.05，表1，圖4)。

圖3 Uba-2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

表1 Transwell法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株侵襲能力

與陰性對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.4 Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá) Western blot法檢測(cè)HepG2細(xì)胞株中TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，Uba-2過(guò)表達(dá)組中TGF-β2的表達(dá)上調(diào)且VEGF、Snail蛋白的表達(dá)量也有所增加，TGF-β1和TGF-β3的表達(dá)量無(wú)明顯變化；而Uba-2干擾表達(dá)組中TGF-β2、VEGF和Snail的表達(dá)均下調(diào)。表明Uba-2的異常表達(dá)會(huì)影響TGF-β2及VEGF、Snail蛋白的表達(dá)(圖5)。

圖5 Western blot法檢測(cè)TGF-β1～3及VEGF、Snail蛋白的表達(dá)

1.陰性對(duì)照組；2.Uba-2干擾表達(dá)組；3.Uba-2過(guò)表達(dá)組；a.Uba-2過(guò)表達(dá)組；b.陰性對(duì)照組；c.Uba-2干擾表達(dá)組

3 討論

腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，環(huán)境、遺傳、基因等均與之發(fā)生有著密切的關(guān)系[7]。如促癌基因的激活、抑癌基因功能被抑制或缺失等均有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。肝癌在全球各種致死腫瘤中位居第3位，原發(fā)性肝癌是最常見的惡性肝腫瘤之一，具有無(wú)特異性臨床表現(xiàn)、病情發(fā)展迅速和易發(fā)生血道轉(zhuǎn)移、手術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，患者確診時(shí)多為中晚期[9]。SUMO通過(guò)參與功能蛋白翻譯后的修飾，在轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及染色體分離等方面發(fā)揮重要作用[10-12]；SUMO靶蛋白不是引導(dǎo)靶蛋白降解，而是通過(guò)和靶蛋白共價(jià)結(jié)合后調(diào)節(jié)靶蛋白的功能，修飾的底物蛋白非常廣泛，參與多種蛋白翻譯后功能的調(diào)節(jié)。在蛋白酶的水解作用下Uba-2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移速度高于陰性對(duì)照組、Uba-2干擾表達(dá)組；Uba-2過(guò)表達(dá)組的平均侵襲細(xì)胞數(shù)高于陰性對(duì)照組和Uba-2干擾表達(dá)組前體蛋白形成成熟的SUMO分子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能與SUMO結(jié)合并被其修飾的蛋白百余種，其大部分是核蛋白，包括p53、MDM2等與轉(zhuǎn)錄及調(diào)控細(xì)胞周期密切相關(guān)的蛋白合[13]；部分為胞質(zhì)表達(dá)，如低氧耐受因子(HIF-1α)，很多癌基因和抑癌基因功能均受SUMO的調(diào)節(jié)，包括p53、雙微基因2(MDm2)、PML等[14]，這些基因的活性、表達(dá)水平及定位的變化對(duì)腫瘤發(fā)展至關(guān)重要。同時(shí)，SUMO分子在活化酶E1作用下激活，SUMO活化酶E1則是由Aos-1和Uba-2兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，且SUMO的激活需Uba-2提供SUMO活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基并形成巰酯鍵，然后再被轉(zhuǎn)移與靶蛋白結(jié)合[8]，SUMO才可被激活。由此可見，Uba-2表達(dá)在SUMO中具有重要意義，雖已知泛素活化酶E1在泛素化信號(hào)通路中的作用機(jī)制及其重要性，了解SUMO和腫瘤關(guān)系密切,可促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15]，但現(xiàn)有針對(duì)泛素活化酶E1主要構(gòu)成物質(zhì)Uba-2參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究相對(duì)較少，Uba-2在肝癌中的表達(dá)機(jī)制及對(duì)肝癌細(xì)胞株中細(xì)胞增殖以及侵襲能力方面的影響尚未完成闡明，鑒于此，本組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肝癌中Uba-2表達(dá)，旨在進(jìn)一步探討Uba-2在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌及癌旁組織中Uba-2 mRNA的表達(dá)，利用Uba-2的過(guò)表達(dá)載體和siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞HepG2，通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)觀察Uba-2在肝癌組織中的差異表達(dá)以及過(guò)表達(dá)和低表達(dá)時(shí)其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。Uba-2在肝癌組織中呈高表達(dá)，較癌旁肝組織中的表達(dá)差異有顯著性；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Uba-2的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力相關(guān)，siRNA干擾沉默HepG2細(xì)胞中Uba-2的表達(dá)會(huì)抑制其增殖生長(zhǎng)；細(xì)胞遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Uba-2的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲轉(zhuǎn)移能力，且與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Uba-2影響與增殖侵襲有關(guān)的信號(hào)分子TGF-β2、VEGF和Snail的表達(dá)水平。推測(cè)肝癌細(xì)胞中Uba-2主要針對(duì)某些與肝癌細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)靶蛋白的SUMO，影響腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲過(guò)程有關(guān)的信號(hào)通路如TGF-β2、VEGF等[16]，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，因此Uba-2在肝癌組織中的高表達(dá)可能具有促進(jìn)肝癌增殖侵襲的作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將探討Uba-2激活SUMO在肝癌細(xì)胞中對(duì)哪些靶蛋白起作用，為肝癌尤其原發(fā)性肝癌發(fā)生機(jī)制的研究以及為肝癌的臨床診斷和生物治療提供有效靶點(diǎn)。

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Expression of Uba-2 in hepatic carcinoma andits effect on the proliferation, invasion and metastasis of hepatoma cells

YUAN Zheng, LI Zhen, SUN Yan-zhen

(DepartmentofPathology,CentralHospitalofNanyang,Nanyang473000,China)

Purpose To investigate the effect of differential expression, over expression and low expression of Uba-2 in hepatic carcinoma on the proliferation and invasion of hepatoma cells. Methods The expression of Uba-2 mRNA in clinical specimens was detected by qRT-PCR. After transfection of Uba-2 over expression vector and siRNA expression vector into hepatoma cell HepG2, the effect of Uba-2 on proliferation of hepatoma cells was detected by MTS assay while the effect on the invasion and metastasis of hepatoma cells was detected by cell migration/invasion assay. The expression levels of TGF-β1-3, VEGF and Snail proteins in hepatoma cell HepG2 were detected by Western blot. Results The expression of Uba-2 was high in hepatic carcinoma. Compared with that in adjacent liver tissues, there were significant differences (P<0.01). qRT-PCR detected over expression or low expression of Uba-2 in HepG2 cells. Cell proliferation data showed that the expression level of Uba-2 was related to the proliferation ability of hepatoma cell HepG2, and siRNA interferring the expression of Uba-2 in silent HepG2 cells could inhibit its growth. The data of cell migration/invasion showed that over expression of Uba-2 could promote the invasion and metastasis of hepatoma cell HepG2. Compared with cells in the control group, there were statistically significant differences. The results of Western blot indicated that the abnormal expression of Uba-2 affected the expression levels of TGF-β2, VEGF and Snail proteins. Conclusion The high expression of Uba-2 gene in hepatic carcinoma may promote the proliferation, invasion and metastasis of hepatoma cells.

hepatic neoplasms; cell proliferation; invasion and metastasis; Uba-2

河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科，南陽(yáng) 473000

袁 征，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: yzyz2128@163.com 李 珍，女，副主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: zhengIi6366@163.com

時(shí)間：2017-8-20 15:27 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.003.html

R 735.7

A

1001-7399(2017)08-0837-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.003

接受日期：2017-06-19