李 力 李曉寧 張仁宇

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710032)

老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經(jīng)細胞凋亡與caspase-3、-4表達的關(guān)系

李 力 李曉寧 張仁宇

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710032)

目的探討老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經(jīng)細胞凋亡與信號傳導(dǎo)通路中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-4表達的關(guān)系。方法老年難治性顳葉癲癇患者21例為難治性顳葉癲癇組，術(shù)中均切除顳葉組織；選取同期因腦外傷入院行手術(shù)入路中必須切除的顳葉組織15例為對照組。免疫組化SP法檢測顳葉組織中神經(jīng)細胞caspase-3、caspase-4陽性表達情況；Western印跡檢測顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白表達情況；TUNEL法檢測兩組神經(jīng)細胞凋亡情況。結(jié)果免疫組化檢測顯示，難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4陽性細胞表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。Western印跡檢測顯示，難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)。對照組顳葉組織中僅存在少量TUNEL陽性神經(jīng)細胞，難治性顳葉癲癇組中TUNEL陽性神經(jīng)細胞數(shù)明顯增多。難治性顳葉癲癇組細胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論老年難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中存在caspase-3、caspase-4傳導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡，同時caspase-3、caspase-4表達水平與神經(jīng)細胞凋亡呈正相關(guān)。

難治性顳葉癲癇；信號傳導(dǎo)；細胞凋亡

癲癇引發(fā)神經(jīng)元凋亡主要包括內(nèi)源性和外源性兩種途徑。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是細胞凋亡的另一場所，提出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑〔1〕。在不同的凋亡途徑中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族成員均起到重要作用，其中caspase-3是內(nèi)源性和外源性途徑中共同的終末成分，發(fā)揮執(zhí)行凋亡的作用〔2〕；caspase-4則與人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑密切相關(guān)〔3〕。本研究旨在探討難治性顳葉癲癇患者顳葉組織中神經(jīng)細胞凋亡情況及信號傳導(dǎo)通路中caspase-3、caspase-4陽性表達情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2016年5月第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院收治的老年難治性顳葉癲癇患者21例，術(shù)中切除顳葉組織。入選標準：①年齡≥60歲，接受手術(shù)治療，均行頭顱CT或磁共振成像(MRI)掃描；②先后單獨使用2種以上一線抗癲癇藥物且達到最大耐受劑量但治療仍無效，平均每月癲癇發(fā)作≥1次，連續(xù)超過6個月；③本次研究通過本院倫理委員會審查，入選患者均簽署知情同意書。男14例，女7例；年齡60～72歲，平均(64.05±3.51)歲；病程2～15年，平均(8.54±4.91)年；強直陣攣發(fā)作15例，復(fù)雜部分性發(fā)作4例，單純部分性發(fā)作、失神發(fā)作各1例。選取同期因腦外傷入院行手術(shù)入路中必須切除的顳葉組織15例為對照組，男9例，女6例；年齡60～70歲，平均(63.61±3.39)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑 兔抗人caspase-3多克隆抗體、兔抗人caspase-4多克隆抗體(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，工作濃度1∶75；KIT-9710即用型免疫組織化學(xué)UltraSensitive TM SP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；原位細胞凋亡檢測試劑盒、DAB顯色試劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海百蕊生物科技有限公司)；GAPDH(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3方法

1.3.1兩組caspase-3、caspase-4在神經(jīng)細胞中的表達 采用免疫組化SP法檢測，以已知的陽性切片為陽性對照，PBS代替一抗為陰性對照，操作按檢測試劑盒說明書進行，染色呈棕黃或棕黑色顆粒為陽性結(jié)果。caspase-3、caspase-4均定位于細胞質(zhì)，先于低倍鏡視野下觀察切片總體表達情況，隨機選取5個完整視野并在高倍鏡視野下拍照。使用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量caspase-3、caspase-4的平均吸光度值。

1.3.2Western印跡檢測 RIPA蛋白裂解試劑盒提取兩組標本組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，取30 μg行PAGE，濕法轉(zhuǎn)移到PVDF膜，奶粉封閉后分別加入兔抗人caspase3、caspase4一抗(1∶1 000稀釋)和小鼠抗人GAPDH一抗(1∶3 000稀釋)，4℃孵化過夜，加入二抗(1∶3 000稀釋)后ECL顯色，用熒光圖像分析儀采集圖像。

1.3.3兩組神經(jīng)細胞凋亡情況檢測 采用TUNEL法檢測，選擇顳葉組織中非壞死區(qū)，用已知的陽性切片為陽性對照，用不含TdT的液體替代TUNEL混合液為陰性對照。TUNEL陽性細胞呈棕褐色，表達于細胞核內(nèi)并呈分散或成片分布，部分染色較深且呈橢圓形或圓形；部分染色不均勻，形態(tài)不規(guī)則。高倍鏡視野下拍照，使用圖像分析軟件計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算陽性細胞率，取5個視野的均值為凋亡指數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組顳葉組織神經(jīng)細胞中caspase-3、caspase-4陽性表達情況 對照組顳葉組織神經(jīng)細胞中存在caspase-3、caspase-4弱表達，難治性顳葉癲癇組caspase-3、caspase-4陽性表達，包括神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中均明顯增多。難治性顳葉癲癇組caspase-3、caspase-4吸光度值分別為(0.70±0.05)、(0.51±0.08)，明顯高于對照組的(0.25±0.03)、(0.19±0.05)(P<0.05)。見圖1。

2.2兩組細胞凋亡情況比較 對照組顳葉組織中僅存在少量TUNEL陽性神經(jīng)細胞，難治性顳葉癲癇組TUNEL陽性神經(jīng)細胞數(shù)明顯增多。難治性顳葉癲癇組細胞凋亡指數(shù)(12.80±2.65)明顯高于對照組(2.47±1.13)(P<0.05)。見圖2。

2.3Western印跡檢測兩組caspase-3、caspase-4蛋白表達情況 難治性顳葉癲癇組顳葉組織中caspase-3、caspase-4蛋白灰度值分別為(0.475±0.082)、(0.690±0.103)，明顯高于對照組的(0.124±0.031)、(0.183±0.035)(P<0.05)。見圖3。

圖1 兩組caspase-3、caspase-4表達情況免疫組化染色(×400)

圖2 兩組細胞凋亡情況

圖3 Western印跡檢測兩組caspase-3、caspase-4蛋白在顳葉組織中的表達

3 討 論

顳葉癲癇是臨床常見的難治性癲癇，在動物實驗?zāi)Ｐ椭幸炎C實特征性的凋亡變化是癲癇發(fā)作后神經(jīng)元損傷的主要表型〔4〕。癲癇發(fā)作時，線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，與胞質(zhì)中的成分相互作用，激活caspase-3而引發(fā)內(nèi)源性凋亡〔5〕。外源性凋亡主要起始于細胞膜上多種死亡受體活化后聚集相關(guān)接頭蛋白，進而活化caspase-8、-10，之后激活caspase-3引發(fā)凋亡〔6〕。除去內(nèi)源性和外源性凋亡途徑之外，癲癇發(fā)病過程中還可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中一個重要的促凋亡蛋白，但其僅存在于部分嚙齒類哺乳動物中，人體中caspase-12基因功能失去〔7〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，人體中caspase-4基因在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中的作用類似于caspase-12〔8〕。癲癇導(dǎo)致的慢性腦損傷晚期神經(jīng)細胞會出現(xiàn)凋亡，因此研究顳葉癲癇神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)機制有助于探尋潛在的抗癲癇途徑。本研究提示人難治性顳葉癲癇顳葉組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中可能存在凋亡相關(guān)的信號傳導(dǎo)。Western印跡檢測結(jié)果說明caspase-3、-4蛋白參與了人難治性顳葉癲癇的凋亡信號傳導(dǎo)，其高表達會提升顳葉組織中細胞凋亡水平。由于癲癇病理變化非常復(fù)雜，既可能是癲癇的原發(fā)改變，也可能是癲癇反復(fù)發(fā)作后的繼發(fā)性改變，本研究中探討的顳葉組織中神經(jīng)細胞凋亡和促凋亡相關(guān)蛋白表達具體是癲癇發(fā)病的原因還是發(fā)病的結(jié)果難以確定，需進一步深入探討。

1Zheng H,Wang X,Tang Z,etal.The PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways mediate the erythropoietin-modulated calcium influx in kainic acid-induced epilepsy〔J〕.Neuroreport,2013;24(6):335-41.

2Bakir-Gungor B,Baykan B,Iseri SU,etal.Identifying SNP targeted pathways in partial epilepsies with genome-wide association study data〔J〕.Epilepsy Res,2013;105(1/2):92-102.

3Gorter JA,Iyer A,White I,etal.Hippocampal subregion-specific microRNA expression during epileptogenesis in experimental temporal lobe epilepsy〔J〕.Neurobiol Dis,2014;62:508-20.

4Meng FX,You Y,Liu ZL,etal.Neuronal calcium signaling pathways are associated with the development of epilepsy〔J〕.Mol Med Rep,2015;11(1):196-202.

5姜立剛,李 雪,李海平,等.局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細胞凋亡的研究〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016;17(2):205-8.

6Russo E,Citraro R,Constanti A,etal.The mTOR signaling pathway in the brain:focus on epilepsy and epileptogenesis〔J〕.Mol Neurobiol,2012;46(3):662-81.

7Liu G,Guo H,Guo C,etal.Involvement of IRE1alpha signaling in the hippocampus in patients with mesial temporal lobe epilepsy.〔J〕.Brain Res Bull,2011;84(1):94-102.

8Berdichevsky Y,Dryer AM,Saponjian Y,etal.PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy〔J〕.J Neuroscience,2013;33(21):9056-67.

〔2017-01-11修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

第四軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)研究課題(LG201422)

李 力(1976-)，男，博士，主治醫(yī)師，講師，主要從事神經(jīng)重癥及腦血管病研究。

R74

A

1005-9202(2017)16-3975-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.030