呂 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊

(武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，湖北 武漢 430022)

苦參堿通過(guò)PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知障礙及神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)作用

呂 路 梅 蕊 王 昉 彭 樊1

(武漢市精神衛(wèi)生中心精神科，湖北 武漢 430022)

目的探討苦參堿通過(guò)蛋白激酶A(PKA)/CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號(hào)通路對(duì)阿爾茨海默病(AD)認(rèn)知障礙及神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)作用。方法48只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、苦參堿組。處理7 d后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能；放射免疫檢測(cè)大鼠血清及海馬組織中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6含量；Western印跡檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白如離子鈣結(jié)合蛋白(Iba)-1、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及PKA/CREB信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，空間探索能力明顯下降，Iba-1、GFAP的表達(dá)顯著增高，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量明顯增多，p-PKA及p-CREB表達(dá)顯著降低(均P<0.01)。與模型組相比，苦參堿組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，空間探索能力顯著增強(qiáng)，Iba-1、GFAP的表達(dá)明顯降低，炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量明顯下降，p-PKA及p-CREB表達(dá)明顯增強(qiáng)(均P<0.01)。與假手術(shù)組相比，苦參堿組各檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論苦參堿能顯著改善AD大鼠認(rèn)知障礙，抑制神經(jīng)炎癥，作用機(jī)制可能與PKA/CREB信號(hào)通路的活化有關(guān)。

苦參堿；阿爾茨海默??；認(rèn)知障礙；神經(jīng)炎癥；小膠質(zhì)細(xì)胞

阿爾茨海默病(AD)是一種常發(fā)于老年人的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退、自理能力下降，同時(shí)伴有各種精神類疾病及行為障礙，其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)急劇升高，65歲以上人群發(fā)病率約為30%，85歲以上患病率增至65%〔1〕。目前對(duì)AD尚無(wú)有效的治療方法?？鄥A是自苦參中提取得到的一種生物堿，具有清熱燥濕、利尿等作用〔2〕。苦參堿具有廣泛的藥理作用，臨床上已被用于乙型肝炎的治療〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿還能防止大鼠肝纖維化，除此之外還具有抗感染、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用〔4～6〕。但是關(guān)于將苦參堿應(yīng)用于AD治療的報(bào)道很少，相關(guān)的作用機(jī)制也不清楚。本研究采用β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42雙側(cè)注射大鼠海馬區(qū)構(gòu)建AD大鼠模型，利用苦參堿進(jìn)行治療，探討苦參堿對(duì)AD大鼠認(rèn)知障礙、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥因子釋放的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院提供；苦參堿注射液購(gòu)自廣州白云山明興制藥有限公司；Aβ1～42、蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Sigma；離子鈣結(jié)合蛋白(Iba)-1單克隆抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、蛋白激酶A(PKA)單克隆抗體、磷酸化(p)-PKA單克隆抗體、CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)單克隆抗體、p-CREB單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)于美國(guó)Abcaminc；放射免疫試劑盒購(gòu)自北京福瑞生物公司；Morris水迷宮購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所；腦立體定位儀購(gòu)自日本Nikon。

1.2方法

1.2.1分組及AD模型制備 使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配制濃度為1 μg/μl的Aβ1～42溶液，37℃恒溫孵育7 d，直至溶液凝聚。取48只健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、苦參堿組。大鼠麻醉處理后進(jìn)行固定，參照《大鼠腦立體定位圖譜》對(duì)大鼠海馬區(qū)進(jìn)行定位。消毒后使用電鉆在定位處鉆一小孔，垂直緩慢注射10 μl的Aβ1～42溶液，模型組及苦參堿組雙側(cè)海馬區(qū)各注射10 μl，假手術(shù)組注射10 μl無(wú)菌0.01 mol/L PBS溶液。完成注射后，使用無(wú)菌的石蠟封堵針口，并對(duì)頭皮進(jìn)行縫合。

1.2.2各組大鼠處理方法 造模后苦參堿組大鼠每日腹腔注射苦參堿注射液40 mg/kg 1次，假手術(shù)組和模型組每日腹腔注射等體積的生理鹽水，連續(xù)處理30 d。

1.2.3Morris水迷宮檢測(cè)大鼠認(rèn)知能力 各組大鼠處理7 d后，每組選6只大鼠，隨機(jī)選擇象限面向池壁放入水中，記錄各只大鼠尋找到平臺(tái)所需時(shí)間，若大鼠90 s內(nèi)尋找到平臺(tái)，讓大鼠在平臺(tái)停留10 s，若大鼠無(wú)法在90 s內(nèi)尋找到平臺(tái)，取出大鼠置于平臺(tái)10 s，并計(jì)時(shí)90 s。訓(xùn)練5 d后，采用不同入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間。撤除水迷宮中的平臺(tái)，隨機(jī)選取入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠穿過(guò)原平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4血清及海馬組織炎癥因子含量檢測(cè) 每組隨機(jī)選擇6只大鼠麻醉后取心臟采集血液，離心后上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中備用。同時(shí)，自腦分離出海馬組織，勻漿后離心取上清。按照放射免疫試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，分別檢測(cè)血清及海馬組織勻漿液中白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6的含量。

1.2.5提取大鼠海馬組織總蛋白 每組隨機(jī)選擇6只大鼠進(jìn)行處死后取海馬組織，每組各取50 mg剪碎后置于離心管中，向離心管中加入500 μl蛋白裂解液及5 μl蛋白酶抑制劑進(jìn)行勻漿。取0.5 ml勻漿液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1 ml蛋白抽提液和10 μl蛋白酶抑制劑，混勻后冰上靜置10 min，離心取中間層溶液，加入2%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，95℃處理10 min，即為所提取蛋白，采取二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)所提取的蛋白濃度。

1.2.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別取50 μg蛋白樣品，按4∶1加入5倍(SDS )上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸5 min制備蛋白樣品。配置蛋白膠，蛋白膠凝固后將蛋白樣品完全加入蛋白凝膠孔中。80 V電泳30 min，待蛋白進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)跑出蛋白凝膠。取出蛋白膠冰浴條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，取出聚偏氟丙烯(PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉3 h，分別加入Iba-1(1∶1 000)、GFAP(1∶800)、PKA(1∶500)、p-PKA(1∶1 000)、CREB(1∶500)、p-CREB(1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗4℃輕輕震蕩孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，常溫輕輕震蕩孵育1 h，TBST清洗后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，置于Quantity One圖像分析系統(tǒng)中成像。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1苦參堿對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，第2天開始顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組明顯縮短，自第3天開始顯著低于模型組(P<0.01)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)〔(1.91±0.95)次〕顯著低于假手術(shù)組〔(5.29±1.12)次〕(P<0.01)，與模型組相比，苦參堿組次數(shù)〔(3.17±1.29)次〕明顯增多(P<0.01)。苦參堿組與假手術(shù)組各檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.2苦參堿對(duì)AD大鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 與假手術(shù)組相比，模型組Iba-1、GFAP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組均明顯降低(P<0.01)；苦參堿組與假手術(shù)組相比兩種蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3苦參堿對(duì)AD大鼠血清及海馬組織炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組均顯著降低(P<0.01)，苦參堿組與假手術(shù)組炎癥因子的表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表3。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s，n=6)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

圖1 Western印跡檢測(cè)大鼠海馬Iba-1、GFAP蛋白表達(dá)

組別Iba?1GFAP假手術(shù)組0215±00260298±0036模型組0510±00911)0562±00731)苦參堿組0363±00192)0338±00262)

表3 各組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子含量比較(±s，μg/L，n=6)

2.4苦參堿對(duì)AD大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白表達(dá)的影響 三組大鼠海馬組織中PKA、CREB蛋白表達(dá)未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)，模型組p-PKA和p-CREB的表達(dá)顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組相比，苦參堿組p-PKA和p-CREB表達(dá)明顯升高(P<0.01)；苦參堿組與假手術(shù)組相比，PKA及CREB蛋白磷酸化無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表4，圖2。

表4 大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白相對(duì)表達(dá)分析(±s，n=6)

圖2 Western印跡檢測(cè)大鼠海馬組織PKA/CREB通路蛋白表達(dá)

3 討 論

AD臨床上是以記憶減退、認(rèn)知障礙及人格改變?yōu)橹饕卣鞯闹袠猩窠?jīng)退行性疾病，研究發(fā)現(xiàn)AD發(fā)病與Aβ在腦內(nèi)的沉積密切相關(guān)，Aβ沉積激活炎癥修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致腦部慢性炎癥損傷，可能是AD的發(fā)病原因〔7〕。Aβ主要包括Aβ1～40和Aβ1～42蛋白，Aβ蛋白在AD患者腦內(nèi)主要以Aβ1～42形式存在，Aβ1～42在細(xì)胞外沉積后，能持續(xù)激活腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)大量的炎癥因子產(chǎn)生〔8〕。實(shí)驗(yàn)證明，海馬區(qū)注射Aβ1～42能更有效建立AD模型〔9〕。本研究通過(guò)向大鼠腦部海馬區(qū)注射Aβ1～42成功制備了AD大鼠模型。

苦參堿是苦參、苦豆子、山豆根等豆科植物的活性成分，具有清熱解毒、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功效。有研究證明苦參堿對(duì)麻醉小鼠腦膜血管具有擴(kuò)張作用，加快局部血流量；其還能明顯抑制腦缺血大鼠環(huán)氧化酶(COX)-2的過(guò)度表達(dá)及膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制腦部炎癥反應(yīng)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明苦參堿能顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。

AD發(fā)病過(guò)程中的神經(jīng)炎癥過(guò)程與腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)〔11，12〕。小膠質(zhì)細(xì)胞是一種免疫細(xì)胞，致炎因素刺激后活化并分泌IL-6、TNF-α等炎癥因子，星形膠質(zhì)細(xì)胞受到外界刺激后活化，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，如IL-1β、IL-6、TNF-α等〔13〕。這些細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)一步刺激炎癥因子的分泌，最終導(dǎo)致神經(jīng)元病變壞死〔14〕，病人出現(xiàn)癡呆等癥狀。Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記蛋白，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記蛋白〔15〕，本研究結(jié)果利用放射免疫檢測(cè)各組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子的含量，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清及海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均明顯升高，與模型組相比，苦參堿組三種炎癥因子的含量顯著降低，苦參堿組與假手術(shù)組炎癥因子的表達(dá)無(wú)明顯差異。說(shuō)明苦參堿能抑制AD大鼠膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制炎癥的發(fā)生。

cAMP是機(jī)體內(nèi)重要的第二信使，通過(guò)PKA調(diào)節(jié)CREB的磷酸化，p-CREB抑制炎癥因子表達(dá)相關(guān)的CRE轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制炎癥的發(fā)生〔16〕；活化PKA/CREB信號(hào)通路還能調(diào)節(jié)下游與神經(jīng)保護(hù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)的作用〔17〕。本研究結(jié)果說(shuō)明苦參堿能活化AD大鼠PKA/CREB信號(hào)通路。

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〔2017-03-16修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

王 昉(1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事精神科研究。

呂 路(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事精神科研究。

R965

A

1005-9202(2017)16-3931-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.010

1 武漢市中醫(yī)醫(yī)院精神科