張道利　高曉艷　姚青

摘要：目的 考察滅菌過程對樣品無菌保證水平的控制效果。方法 采用外加陽性菌金黃色葡萄球菌的方法，按照《中國藥典》2010 年版無菌檢查法進(jìn)行方法學(xué)驗證試驗。結(jié)果 經(jīng)過10次驗證試驗得出，滅菌工序?qū)ξ⑸锶コ黠@，去除率達(dá)到100.00%。結(jié)論 經(jīng)過10次驗證試驗，得出滅菌工序?qū)ξ⑸锶コ黠@，能夠有效的截留微生物，有效確保熱毒寧注射液的無菌安全性。

關(guān)鍵詞：熱毒寧注射液；無菌檢查；滅菌

中圖分類號：R286 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）17-0093-03

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗儀器 所需實驗儀器包括HTY-2000A型集菌儀（編號：424049，杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），PY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），雙人凈化工作臺YJT（編號：424094，靖江市磊鑫機(jī)械廠），生物安全柜（編號：424076，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司），脈動真空滅菌器DMG-0.28（編號：424013，連云港千櫻公司），生化培養(yǎng)箱LRH-250（編號：424164，上海一恒科技有限公司），霉菌培養(yǎng)箱MJ-250-1（編號：424158，上海一恒科技有限公司）。

1.1.2實驗培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號：20140221，宜興市永信生物有限公司），改良馬丁培養(yǎng)基（批號：20140222，宜興市永信生物有限公司），改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：2014082，宜興市永信生物有限公司），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：20141110，宜興市永信生物有限公司），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：20140831，宜興市永信生物有限公司），熱毒寧注射液（規(guī)格：10 ml/支，批號：150206、150207、150208、150209、150210、150301、150302、150303、150304、150305，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）。

1.1.3實驗菌種 枯草桿菌CMCC（B）（編號：63501-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），金黃色葡萄球菌CMCC（B）（編號：26003-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），大腸埃希菌CMCC（B）（編號：44102-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），生孢梭菌 CMCC（B）（編號：64941-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），白色念珠菌CMCC（F）（編號：98001-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），黑曲霉CMCC（F）（編號：98003-4，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）。

1.2方法

1.2.1滅菌工序去除細(xì)菌數(shù) 取熱毒寧注射液（批號：150206）10批滅菌前后藥液適量進(jìn)行無菌檢查[1]。結(jié)果顯示，滅菌前后熱毒寧注射液中微生物含量太低，無法評估滅菌工序?qū)ξ⑸锏奈叫Ч?，因此，采用加陽性菌的方法在滅菌前藥液中加入適量金黃色葡萄球菌數(shù)，并模擬生產(chǎn)過程中滅菌工序進(jìn)行操作[2]。

取灌封后滅菌前藥液，加入金黃色葡萄球菌數(shù)適量，使滅菌前藥液中含外加陽性菌含量<100 cfu/ ml，混勻，作為滅菌前供試液，備用。開啟滅菌檢漏器，按設(shè)定的程序進(jìn)行滅菌：滅菌溫度100 ℃，置換溫度95 ℃，滅菌時間45 min，清洗時間20 min，檢漏時間5 min，滅菌真空度-0.080 MPa，滅菌壓力0.020 MPa。滅菌溫度為100 ℃，時間為45 min。得到滅菌后供試液。分別取滅菌前供試液（C1）和滅菌后供試液（C2），以無菌檢查法檢測其中的微生物含量，并按以下公式計算：微生物去除率 Q1=（C1-C2）/C1×100%。

1.2.2菌液制備方法[3-4] ①取金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]第4代新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-7，制成每1 ml含菌數(shù)為95 cfu、87 cfu、85 cfu的菌懸液各30 ml，備用；②取大腸埃希菌[CMCC（B）44102]第4代新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-7，制成每1 ml含菌數(shù)為73 cfu、69 cfu、82 cfu的菌懸液各30 ml，備用；③取枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]第4代新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-6，制成每1 ml含菌數(shù)為69 cfu、61 cfu、64 cfu的菌懸液各30 ml，備用；④取生孢梭菌[CMCC（B）64941]第4代新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-5，制成每1 ml含菌數(shù)為47 cfu、51 cfu、34 cfu的菌懸液各30 ml，備用；⑤取白色念株菌[CMCC（F）98001]第4代新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-6，制成每1 ml含菌數(shù)為97 cfu、90 cfu、88 cfu的菌懸液各30 ml，備用；⑥取黑曲霉菌[CMCC（F）98003]第4代改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加入5 ml含0.05%的聚山梨酯80 ml的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出1 ml孢子懸液新鮮肉湯培養(yǎng)基1 ml+9 ml 0.9%無菌NaCl溶液，10倍系列稀釋至10-5，制成每1 ml含菌數(shù)為64 cfu、61 cfu、58 cfu的菌懸液[5-6]各30 ml，備用。菌液制備結(jié)果見表1。

1.2.3供試品溶液的制備 取熱毒寧注射液240支，通過HTY-2000A型集菌儀平均過濾置6個APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器中。

1.2.4薄膜過濾 ①安裝好APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器，每2個一組，共6組；②調(diào)節(jié)HTY-2000A型集菌儀泵速為160 r/min，用適量的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜；③一個APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器取熱毒寧注射液20支直接過濾樣品溶液；④在APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器中加入<100 cfu/ml的試驗菌金黃色葡萄球菌；⑤根據(jù)6種試驗菌的類別選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基加入到APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器中；⑥在另一APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器中加入等量的對應(yīng)培養(yǎng)基和金黃色葡萄球菌懸液；⑦其余五株試驗菌按上述方法同法操作；⑧培養(yǎng)：將6組APY一次性使用全封閉集菌培養(yǎng)器分別置規(guī)定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察試驗組和對照組的微生物生長情況[6-7]。endprint

2 結(jié)果

與對照組比較，試驗組菌落生長情況良好，說明熱毒寧注射液在此檢驗量和檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計。因此，可以按照此檢查條件采取薄膜過濾檢查法進(jìn)行熱毒寧注射液的無菌檢查[5-6]。滅菌工序去除細(xì)菌數(shù)的檢測結(jié)果見表2、表3。試驗結(jié)果見表4。

3討論

根據(jù)藥理學(xué)試驗表明，熱毒寧注射液對2，4-二硝基苯酚，三聯(lián)疫苗導(dǎo)致家兔發(fā)熱存在解熱效果，大腸桿菌導(dǎo)致大鼠發(fā)熱，能夠使流感病毒造成小鼠平均存活時間得到延長，降低流感病毒對于小鼠肺感染指數(shù)，通過能夠降低金黃色葡萄球菌感染小鼠以及肺炎克雷伯氏菌感染小鼠的死亡幾率，對于二甲苯引發(fā)的小鼠耳廓腫脹起到抑制作用，提升小鼠血清碳粒廓清指數(shù)，增強(qiáng)血清溶血素水平，提高羊紅細(xì)胞引發(fā)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，對于醋酸引發(fā)小鼠扭體疼痛反映起到抑制效果。熱毒寧注射液制備過程中對微生物有多步控制程序，活性炭吸附、超濾膜的使用、過程中的干熱滅菌柜和隧道烘箱的使用、除菌過濾濾芯的使用、層流的保護(hù)、隔離器的使用、酸堿的使用、環(huán)境的熏蒸（臭氧、丙二醇）、消毒劑的使用等[7]。本實驗中采用外加陽性菌金黃色葡萄球菌的方法，經(jīng)過10次驗證試驗，得出滅菌工序?qū)ξ⑸锶コ黠@，去除率達(dá)到100.00%，能夠有效的截留微生物，有效的確保熱毒寧注射液的安全性。

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[7]許真玉.注射劑滅菌工藝變更常見問題分析[J].中國新藥雜志，2014，23（11）：1248-1251.

編輯/張建婷endprint