王憲靈 王縛鯤 賈克然 趙會(huì)海 張海譜

·論著·

尿培養(yǎng)標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)的價(jià)值

王憲靈 王縛鯤 賈克然 趙會(huì)海 張海譜

目的探討尿培養(yǎng)標(biāo)本采用美華MA120系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌直接鑒定及藥敏試驗(yàn)方法的可靠性和臨床應(yīng)用價(jià)值。方法住院疑似尿路感染患者送檢中段尿標(biāo)本835份，從中篩選出符合比對(duì)要求的標(biāo)本492份，分別采用經(jīng)典手工方法、常規(guī)培養(yǎng)法和直接方法(美華MA120系統(tǒng))進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，以經(jīng)典手工方法為標(biāo)準(zhǔn)，分析直接方法細(xì)菌鑒定的正確率、未鑒定率及錯(cuò)誤率，藥敏試驗(yàn)的正確率、有誤差率及錯(cuò)誤率，并與常規(guī)培養(yǎng)法相比較。結(jié)果492份標(biāo)本共檢測(cè)到革蘭陰性桿菌369株，革蘭陽(yáng)性球菌123株。常規(guī)培養(yǎng)法鑒定細(xì)菌的正確率為88.82% (437/492)、未鑒定率為6.91%(34/492)、錯(cuò)誤率為4.27%(21/492)；直接法鑒定的正確率為85.37%(420/492)、未鑒定率為10.16%(50/492)、錯(cuò)誤率為4.47%(22/492)，兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接法的革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)正確率分別為94.04%和93.13%，有誤差率分別為4.12%和4.01%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但常規(guī)培養(yǎng)法的平均錯(cuò)誤率1.84%明顯低于直接方法的平均錯(cuò)誤率2.85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接法的革蘭陽(yáng)性球菌的藥敏試驗(yàn)正確率分別為92.89%和86.79%，有誤差率分別為5.39%和9.65%，錯(cuò)誤率分別為1.73%和3.56%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論應(yīng)用美華MA120對(duì)尿培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定及藥敏試驗(yàn)時(shí)，細(xì)菌鑒定及革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較可靠，可以為臨床合理使用抗菌藥物提供參考依據(jù)，但革蘭陽(yáng)性球菌的藥敏結(jié)果的可靠性有待進(jìn)一步論證。

尿培養(yǎng)；直接細(xì)菌鑒定；藥敏試驗(yàn)

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是臨床常見(jiàn)感染性疾病之一，抗菌藥物使用中很大部分用于治療UTI。經(jīng)驗(yàn)性推薦使用治療UTI的抗菌藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：除呋喃妥因外沒(méi)有其他能夠滿足需要的廣譜抗生素用于治療UTI。由于常規(guī)培養(yǎng)和藥敏方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能及時(shí)報(bào)告細(xì)菌耐藥結(jié)果，一方面造成無(wú)效治療，另一方面增加患者負(fù)擔(dān)，造成疾病遷延不愈。因此早期識(shí)別UTI的病原菌以及藥敏結(jié)果可以明顯提高治愈率，并且降低患者藥品、實(shí)驗(yàn)室檢查等費(fèi)用。近年來(lái)，隨著細(xì)菌自動(dòng)化鑒定和藥敏分析系統(tǒng)的發(fā)展，大部分細(xì)菌的鑒定和藥敏分析結(jié)果可以在2～12 h內(nèi)得到，而且有很高的準(zhǔn)確性。將尿培養(yǎng)標(biāo)本直接用自動(dòng)化鑒定和藥敏系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)在國(guó)外已有研究，并取得一定結(jié)果[1]。本研究中，我們利用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)及其配套測(cè)試卡對(duì)尿培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)的研究，并和常規(guī)方法比較，探討該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年12月在我院住院疑似USI患者送檢中段尿培養(yǎng)標(biāo)本835份。所有標(biāo)本為晨起留取中段尿，尿常規(guī)檢測(cè)(UF1000)白細(xì)胞數(shù)≥500 WBC/μl，2 h內(nèi)送檢。患者男212例，女623例；年齡3～87歲，平均60.4歲。

1.2儀器與試劑珠海美華生物科技公司MA120型細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)及其配套檢測(cè)板，細(xì)菌鑒定試劑購(gòu)自杭州天和生物制品公司，血基礎(chǔ)培養(yǎng)基為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本篩選與預(yù)處理:參考文獻(xiàn)[1]中的方法首先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行篩選。取中段尿標(biāo)本5 ml加入無(wú)菌離心管中，1 000 g/min離心1 min，上清轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌離心管中，10 000 g/min離心10 min，棄去上清留底部約留50 μl打散，用10 μl接種環(huán)取菌液加在玻片上自然干燥，固定后染色鏡檢，根據(jù)染色結(jié)果確定進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本。經(jīng)篩選共有302份標(biāo)本不符合要求，未進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，其中鏡檢大于1種細(xì)菌的115份(38.08%)，檢測(cè)為酵母菌的27份(8.9%)，未檢測(cè)到細(xì)菌或細(xì)菌數(shù)目小于30個(gè)/油鏡視野的137份(45.36%),樣本量少不適于實(shí)驗(yàn)的23份(7.62%)。其他533份標(biāo)本初步篩選合乎要求可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2經(jīng)典手工方法和常規(guī)培養(yǎng)方法:經(jīng)典手工方法參考臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行常規(guī)尿細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，并利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。常規(guī)培養(yǎng)法為取尿液定量接種于普通血平板及巧克力平板，在35℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h形成菌落后，首先進(jìn)行細(xì)菌定量，對(duì)≥103/ml的樣本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。根據(jù)細(xì)菌菌落革蘭染色結(jié)果，革蘭陽(yáng)性菌進(jìn)行觸媒試驗(yàn)，觸媒試驗(yàn)陽(yáng)性球菌利用葡萄球菌板，觸媒試驗(yàn)陰性球菌利用鏈/腸球菌板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陰性菌接種克氏雙糖管，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇腸桿菌鑒定板或非發(fā)酵菌鑒定板進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.3.3直接細(xì)菌鑒定和藥敏方法:取離心后的菌液根據(jù)要求制備0.5～1.0 McF菌液，以無(wú)菌滴管吸取少量菌液，依據(jù)1.3.1的革蘭染色結(jié)果，陽(yáng)性菌進(jìn)行觸媒試驗(yàn)，觸媒試驗(yàn)陽(yáng)性球菌利用葡萄球菌鑒定板，觸媒試驗(yàn)陰性球菌利用鏈/腸球菌鑒定板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陰性菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)陰性桿菌利用非發(fā)酵菌鑒定板，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性桿菌利用腸桿菌鑒定板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陽(yáng)性菌溫箱孵育24 h、革蘭陰性菌溫箱孵育8 h后取出進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析533份標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)，其中32份標(biāo)本有2中以上細(xì)菌生長(zhǎng)，9份標(biāo)本無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，不適宜進(jìn)行對(duì)比分析，實(shí)際進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的標(biāo)本為492份。以經(jīng)典手工方法為標(biāo)準(zhǔn)，分析應(yīng)用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和直接細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確率，并比較兩種方法的差異；藥敏試驗(yàn)的結(jié)果分為3種，正確、有誤差和錯(cuò)誤，分析并比較常規(guī)培養(yǎng)和直接藥敏試驗(yàn)的正確率。由于革蘭陰性桿菌和革蘭陽(yáng)性球菌所做的藥物敏感試驗(yàn)差異較大，所以分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 13.0軟件完成，兩者比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷定義表

注：R:耐藥；I：中介；S：敏感

2 結(jié)果

2.1 492例尿培養(yǎng)標(biāo)本的細(xì)菌鑒定結(jié)果492例尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本共檢測(cè)到革蘭陰性桿菌369株，革蘭陽(yáng)性球菌123株，檢出最多的分別是大腸埃希菌278株(56.50%)，表皮葡萄球菌42株(8.54%)、屎腸球菌31株(6.30%)、肺炎克雷伯菌27株(5.49%)、糞腸球菌26株(5.28%)，奇異變形桿菌23株(4.67%)。采用常規(guī)培養(yǎng)法細(xì)菌鑒定的正確率為88.82%(437/492)、未鑒定率為6.91%(34/492)、鑒定錯(cuò)誤率為4.27%(21/492)；采用直接法鑒定的正確率為85.37%(420/492)、未鑒定率為10.16%(50/492)鑒定錯(cuò)誤率為4.47%(22/492)，兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.613,P=0.106; χ2=3.332,P=0.068;χ2=0.024,P=0.876)。檢出最多的大腸埃希菌和表皮葡萄球菌常規(guī)培養(yǎng)法鑒定的正確率分別為85.25%(237/278)和97.62%(41/42)，與采用直接法鑒定的正確率84.17%(234/278)和90.48%(38/42)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.125,P=0.724；F=0.360)。其他細(xì)菌由于例數(shù)較少未做統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)表2。

2.2革蘭陰性桿菌藥敏結(jié)果分析以經(jīng)典手工法為標(biāo)準(zhǔn)，分析采用常規(guī)培養(yǎng)法所鑒定的369株革蘭陰性桿菌對(duì)15種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其平均正確率94.04%、有誤差率4.12%與采用直接法的平均正確率93.13%、有誤差率4.01%相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.76,P=0.05;χ2=0.83,P=0.77)，但常規(guī)培養(yǎng)法的平均錯(cuò)誤率1.84%明顯低于直接法的平均錯(cuò)誤率2.85%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.35,P=0.00)。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明兩種方法對(duì)所有369株革蘭陰性桿菌檢測(cè)的藥敏結(jié)果正確率均無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.3革蘭陽(yáng)性球菌藥敏分析結(jié)果以經(jīng)典手工法為標(biāo)準(zhǔn)，分析采用常規(guī)培養(yǎng)法所鑒定的123株革蘭陽(yáng)性球菌對(duì)16種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其平均正確率92.89%、有誤差率5.39%、錯(cuò)誤率1.73%，與采用直接法的平均正確率86.79%、有誤差率9.65%、錯(cuò)誤率3.56%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為40.07、25.78、12.80,P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接方法的多西環(huán)素正確率分別為100%和94.31%，克林霉素正確率分別為91.87%和77.24%，克拉霉素正確率分別為91.06%和73.98，兩種方法比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

3 討論

尿路感染治療最重要的是選擇有效的抗菌藥物，合理使用抗菌藥物，可以有效減少尿路感染患者住院天數(shù)，改善患者預(yù)后，減少治療費(fèi)用[2-4]。由于常規(guī)培

表2 492例標(biāo)本兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果比較 份

注：與常規(guī)方法比較，*P<0.05

表3 369株革蘭陰性桿菌藥敏分析結(jié)果 份(%)

注：與常規(guī)培養(yǎng)法比較，*P<0.05

表4 123株革蘭陽(yáng)性球菌藥敏分析結(jié)果 份(%)

注：與常規(guī)方法比較，*P<0.05

養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)，通常在藥敏結(jié)果報(bào)告前，臨床都是依靠經(jīng)驗(yàn)選擇用藥。針對(duì)尿路感染推薦的經(jīng)驗(yàn)性抗感染藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：除呋喃妥因外沒(méi)有其他能夠滿足需要的廣譜抗生素用于治療尿路感染[5,6]。而我們所做的研究顯示在腎盂腎炎患者中依靠經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用抗菌藥物總的有效率僅為64.1%[7],這表明依靠經(jīng)驗(yàn)用藥所用抗菌藥物許多都是無(wú)效用藥，延誤了患者治療，造成患者經(jīng)濟(jì)損失和醫(yī)療資源的巨大浪費(fèi)。因此早期識(shí)別尿路感染中的病原菌以及藥敏結(jié)果有重要意義。采用尿液標(biāo)本直接進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，可以在8～24 h內(nèi)得到結(jié)果，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間。雖然NCCLS未推薦尿液標(biāo)本進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，但國(guó)外的研究表明，采用自動(dòng)化儀器對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果可靠，并取得良好應(yīng)用效果[1]。本研究利用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)及其配套測(cè)試卡對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定及藥敏試驗(yàn)，可以極大縮短檢測(cè)時(shí)間，有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)492例尿培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，直接法鑒定的正確率85.37%與常規(guī)培養(yǎng)法的正確率88.82%比較無(wú)明顯差異。藥敏結(jié)果表明，采用直接法的平均正確率93.13%與常規(guī)培養(yǎng)法的平均正確率94.04%相比無(wú)明顯差異。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明，兩種方法對(duì)所有369株革蘭陰性桿菌的藥敏結(jié)果正確率均無(wú)明顯差異。采用常規(guī)培養(yǎng)法的革蘭氏陽(yáng)性球菌藥敏結(jié)果平均正確率92.89%明顯高于采用直接方法的平均正確率86.79%，差異顯著。分析直接法革蘭陽(yáng)性球菌藥敏試驗(yàn)平均正確率較低的原因，是因?yàn)橛袔追N抗生素的正確率直接法明顯低于常規(guī)培養(yǎng)法。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明，革蘭氏陽(yáng)性球菌對(duì)多西環(huán)素、克林霉素、克拉霉素的藥敏試驗(yàn)兩種方法比較正確率有差異。分析多西環(huán)素、克林霉素、克拉霉素錯(cuò)誤率較高的原因第一可能是細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)本身的原因，這幾種藥物的敏感性和穩(wěn)定性存在差異；第二可能是細(xì)菌方面的原因，因?yàn)槌霈F(xiàn)錯(cuò)誤的多為具有生長(zhǎng)較慢、生化特征不明顯、難以鑒定等特點(diǎn)的細(xì)菌，本身鑒定比較困難。國(guó)外相關(guān)研究表明，尿液培養(yǎng)標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定正確率為82.3%[1]。藥敏試驗(yàn)正確率為84.7%，本研究中革蘭陽(yáng)性球菌雖然直接法藥敏正確率低于常規(guī)方法，但仍高達(dá)86.79%，表明本系統(tǒng)的鑒定和藥敏結(jié)果可以接受，可被臨床參考應(yīng)用。

本研究應(yīng)用國(guó)產(chǎn)自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)篩選的尿液培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定藥敏試驗(yàn)，革蘭陰性桿菌選在8 h測(cè)定結(jié)果，因?yàn)榇蠖喔锾m陰性桿菌生長(zhǎng)迅速，8 h測(cè)定不影響結(jié)果，而且也可以在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將結(jié)果報(bào)告臨床醫(yī)生方便醫(yī)生調(diào)整用藥；革蘭陽(yáng)性球菌選在24 h后測(cè)定，是因?yàn)檠芯恐邪l(fā)現(xiàn)，本系統(tǒng)對(duì)大部分陽(yáng)性球菌10 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定所得的結(jié)果不準(zhǔn)確，因?yàn)榇蟛糠株?yáng)性球菌在本系統(tǒng)生長(zhǎng)較慢，需要培養(yǎng)過(guò)夜才能得到可靠結(jié)果，但這也比常規(guī)實(shí)驗(yàn)先得到純菌落再進(jìn)行試驗(yàn)大大縮短了時(shí)間，對(duì)臨床具有積極意義。與國(guó)外相關(guān)系統(tǒng)比較[8]，革蘭陽(yáng)性球菌直接鑒定藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要進(jìn)一步提高，而且在幾種特殊抗生素的的藥敏試驗(yàn)中正確率較低，需要特別注意。綜上所述，應(yīng)用國(guó)產(chǎn)自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定藥敏試驗(yàn)，結(jié)果可靠，快速，經(jīng)濟(jì)，可以為臨床合理使用抗菌藥物提供及時(shí)、可靠的幫助。

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050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科

張海譜,050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科;

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A

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2016-11-12)