劉濤+錢立全

[摘要] 目的 探究臭氧對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。 方法 選擇2016年1—12月期間36只大鼠。均行體外培養(yǎng)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。依培養(yǎng)基所輸氣體的不同將其均分至A、B、C 3組。A組加入純氧進(jìn)行作用；B、C兩組則分別加入400 μL的臭氧（O3）進(jìn)行20 min的作用，其中B組所加臭氧規(guī)格為40 μg/mL，C組所加臭氧規(guī)格為80 μg/mL，對比3組不同培養(yǎng)基下大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的差異。結(jié)果 B組大鼠Ast的LDH漏出率在培養(yǎng)2 h時為（18.4±2.5）%，4 h時為（18.9±2.6）%，均優(yōu)于A組（P<0.05）；而C組大鼠LDH漏出率在2、4 h時分別為：（30.7±5.6）%、（35.0±4.5）%，均明顯高于A組（P<0.01）。結(jié)論 高濃度的臭氧在短時間內(nèi)對大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的損傷作用，而低濃度臭氧如40 μg/mL則無上述作用。

[關(guān)鍵詞] 星形膠質(zhì)細(xì)胞；體外培養(yǎng)；完全培養(yǎng)基；臭氧；作用

[中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）06（b）-0044-03

[Abstract] Objective To study the effect of ozone on the astrocytes function of rats. Methods 36 rats in our hospital from January to December 2016 were selected and underwent the in vitro culture and immunocytochemical identification， and they were divided into the three groups according to different media gas， the group A adopted the pure oxygen for function， the group B and group C respectively adopted the 400 μL ozone for 20 min function， and the ozone specification in the group B and in the group C was respectively 40 μg/mL and 80 μg/mL， and the difference in the astrocytes between the three groups was compared. Results In the group B， the LDH leakage rate of rats Ast in the group B was （18.4±2.5）% at 2 h and （18.9±2.6）% at 4 h， which were better than those in the group A，（P<0.05）， and the LDH leakage rate in the group C was respectively （30.7±5.6）% and （35.0±4.5）% at 2 h and 4 h， which were obviously higher than those in the group A（P<0.01）. Conclusion The high-concentration ozone has an obvious injury effect on the astrocytes function of rats in a short time， but the low-concentration ozone such as 40ug/ml cant produce the same effect.

[Key words] Astrocytes； In vitro culture； Complete medium； Ozone； Function

隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，醫(yī)用氣體的不斷進(jìn)步，使得臭氧的應(yīng)用也越發(fā)廣泛。大量研究表明，濃度適宜的臭氧不僅能夠有效抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)、減少新生血管的生成，而且能夠有效調(diào)節(jié)機(jī)體相關(guān)組織供氧、抑制相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)。尤其是在脊柱源性腰腿痛以及腦缺血等病癥方面具有顯著療效。但研究亦發(fā)現(xiàn)，對于長期接觸的人群如印刷工人往往會因長期處于低濃度臭氧環(huán)境中而出現(xiàn)腦損傷等病癥。隨著對臭氧研究的不斷深入，不少研究發(fā)現(xiàn)臭氧對于星形膠質(zhì)細(xì)胞也具有一定的影響作用[1]。因此，該文就臭氧對2016年1—12月期間培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用情況進(jìn)行更進(jìn)一步探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

36只實(shí)驗(yàn)大鼠均取自該院實(shí)驗(yàn)中心，且均為1～2日齡SD乳大鼠。研究所用儀器及試劑有：E80醫(yī)用臭氧發(fā)生器、Forma371型二氧化碳孵育箱、DMEM/F12培養(yǎng)基、乳酸脫氫酶試劑盒（LDH試劑盒）、胎牛血清（FCS）、鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）以及臺盼藍(lán)和胰蛋白酶等。

1.2 方法

1.2.1 Ast的培養(yǎng)及特征鑒定 （1）對36只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行統(tǒng)一的Ast培養(yǎng)。一般現(xiàn)取乙醚對大鼠進(jìn)行麻醉處理，麻醉后立即采用濃度為75%的乙醇進(jìn)行全面的消毒，而后進(jìn)行手術(shù)取腦操作，取腦后立即將大鼠的大腦皮質(zhì)進(jìn)行有效的分離，并用吸管進(jìn)行吹氣處理，直至大腦皮質(zhì)成糊狀停止吹氣，而后使用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理，時間以10 min為宜。同時制備完全培養(yǎng)基，即取DMEM/F12為主，并添以10%的FCS進(jìn)行終止消化，然后進(jìn)行過濾、離心操作。孵育箱內(nèi)相關(guān)參數(shù)設(shè)定為5%CO2+95%空氣，溫度37℃，濕度則應(yīng)設(shè)置為飽和濕度，孵育時間以20 min為宜。孵育完成后立即將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，并隨即將細(xì)胞懸液吸出，進(jìn)而有效去除懸液中成纖維細(xì)胞。翻轉(zhuǎn)吸液操作應(yīng)進(jìn)行兩次。在成纖維細(xì)胞去除完畢后，立即進(jìn)行接入培養(yǎng)皿的接種操作，接種時細(xì)胞濃度應(yīng)調(diào)為1.5×106/mL，并且需1～2 d將培養(yǎng)液進(jìn)行換液1次，并倒置于顯微鏡下對Ast的形態(tài)情況及生長規(guī)律進(jìn)行觀察記錄。培養(yǎng)以細(xì)胞鋪滿瓶底且胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)培養(yǎng)到第3周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[2]。

（2）進(jìn)行Ast的特征鑒定，即通過GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行特征的鑒定。③使用中性甲醛進(jìn)行10～12 min的固定，而后使用過氧化酶進(jìn)行阻斷處理，時間以10 min為宜。②將鼠抗（一抗）-抗GFAP抗體置于溫度為4℃的冰箱中過夜，而二抗則先放置于室溫下10 min，鏈親合素-過氧化酶溶液10 min，最后采用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色。

1.2.2 臭氧干預(yù)實(shí)驗(yàn) 采用24孔培養(yǎng)板承接細(xì)胞傳代，每孔承接細(xì)胞接種以7×105個細(xì)胞為宜，然后于第2天將細(xì)胞貼壁牢固，并依據(jù)干預(yù)所用氣體的不同將其均分至A、B、C 3組。3組均采用Giuseppe所用方法，即利用“Y”形三通連接管，連接兩注射器，分別自臭氧發(fā)生器、氧氣袋內(nèi)抽取臭氧或氧氣，然后將氣體快速推至含有相同體積、相同組分的完全培養(yǎng)基中（CM）的注射器內(nèi)，并連續(xù)搖動，3組搖動作用時間均以20 min為宜。其中，A組加入純氧進(jìn)行作用（一般以400 μL的純氧作用20 min）；B、C兩組則分別加入400 μL的臭氧（O3）進(jìn)行20 min的作用，其中B組所加臭氧規(guī)格為40 μg/mL，C組所加臭氧規(guī)格為80 μg/mL。作用完成后立即將3組細(xì)胞放回CO2孵育箱內(nèi)，并分別于放回箱內(nèi)的2 h和4 h收集其各自細(xì)胞上清液，并將細(xì)胞刮下后于冰浴中令其破碎。最后，進(jìn)行LDH漏出率測定以及細(xì)胞死亡百分比的計(jì)算。其中，LDH漏出率的測定主要通過對兩時間節(jié)點(diǎn)所取上清液和細(xì)胞勻漿液中二者吸光度值測定，一般采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定，而后依照LDH漏出率公式進(jìn)行計(jì)算。而細(xì)胞死亡百分比的測定則分別采用臺盼藍(lán)進(jìn)行計(jì)數(shù)200個相鄰細(xì)胞中染藍(lán)、未染藍(lán)細(xì)胞個數(shù)，進(jìn)而計(jì)算死亡細(xì)胞百分比[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料應(yīng)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LDH漏出率差異

A組2 h與4 h漏出率大致相同，約為23%；而B組無論是2 h還是4 h其漏出率值均明顯小于A組，組間對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而組內(nèi)其兩節(jié)點(diǎn)對比則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而C組無論是2 h還是4 h兩節(jié)點(diǎn)漏出率值較之AB兩組均明顯升高（P<0.05），且組內(nèi)對比4 h漏出率值也明顯高于2 h的值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 細(xì)胞死亡百分比差異

A組2 h和4 h死亡細(xì)胞百分比均約為11%，B組則在10%左右，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而C組無論是2 h還是4 h其死亡細(xì)胞百分比均顯著高于A、B兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時，組內(nèi)對比C組4 h的死亡細(xì)胞百分比也明顯大于2 h（P<0.05）。見表2。

3 討論

作為人體腦神經(jīng)細(xì)胞中占比最高的神經(jīng)細(xì)胞之一，星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅具有營養(yǎng)神經(jīng)元、支持神經(jīng)元的作用，而且能夠有效清除危害神經(jīng)元的毒性氨基酸，進(jìn)而有效保護(hù)神經(jīng)元，令神經(jīng)元正常發(fā)揮其應(yīng)有作用。隨著臨床上對星形膠質(zhì)細(xì)胞研究的不斷深入，尤其是在這個中樞神經(jīng)損傷頻繁的大背景下，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，諸如細(xì)胞因子、趨化因子等很多炎癥介質(zhì)均是由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌而來，這些炎癥介質(zhì)的分泌有效的調(diào)節(jié)了神經(jīng)元的各項(xiàng)功能，進(jìn)而促進(jìn)大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常工作[3]。

臭氧作為目前大氣污染中常見的一種組分，不僅已有大量研究表明該氣體對呼吸道具有明顯的損傷作用，而且對于腦神經(jīng)細(xì)胞尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞也有一定的消極影響。但也有研究表明，適量的臭氧不僅不會損害人體細(xì)胞，而且有助于抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)組織缺氧的積極作用[4]。進(jìn)一步研究表明，作為氧元素單質(zhì)的一種，臭氧不僅理化性質(zhì)不穩(wěn)定，而且其氧化性極強(qiáng)，加之其作用靶分子為機(jī)體內(nèi)的不飽和脂肪酸，因此，細(xì)胞膜是臭氧最易侵襲損害的部位。而細(xì)胞膜的受損又會導(dǎo)致細(xì)胞中LDH釋放的增多，即漏出率增大。臨床上也常常以細(xì)胞LDH的漏出率大小來判定細(xì)胞受損的具體情況[5]。同時，細(xì)胞膜受損將直接影響細(xì)胞膜的通透性，因此，采用臺盼藍(lán)等染色物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞染色，可通過染藍(lán)（死亡細(xì)胞）與未染藍(lán)（存活細(xì)胞）情況來判定細(xì)胞死亡情況，進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞死亡百分比[6-7]。

該文就臭氧對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用情況進(jìn)行了更進(jìn)一步探究，結(jié)果表明，B組大鼠Ast的LDH漏出率在培養(yǎng)2 h時為（18.4±2.5）%，4 h時為（18.9±2.6）%，均優(yōu)于A組（P<0.05）；而C組大鼠LDH漏出率在2、4 h時分別為：（30.7±5.6）%、（35.0±4.5）%，均明顯高于A組（P<0.01）。這與董力等[8]相似研究結(jié)果一致，其研究表明大鼠Ast的LDH漏出率在培養(yǎng)2 h時為（17.8±5.3）%，4 h時為（16.4±2.9）%，均與該文研究組結(jié)果相似。深入分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于實(shí)驗(yàn)大鼠Ast高濃度的臭氧的確具有明顯的損傷作用。無論在LDH漏出率方面，還是死亡細(xì)胞百分比方面，高濃度的（80 μg/mL）臭氧的C組均明顯高于純氧的A組與低濃度臭氧的B組（40 μg/mL），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。即高濃度臭氧對于大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞具有明顯的損害作用。

綜上所述，純氧及低濃度臭氧對大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞無消極影響，而高濃度臭氧則具有明顯的損傷作用，對此臨床上應(yīng)予以高度重視。

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（收稿日期：2017-03-12）