陳志強(qiáng)， 王 瑩△， 葉才果， 米賢軍， 陳 昂， 鐘守軍，黃華勇， 徐秀梅， 代新珍， 鄧文同， 劉超凡

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院病理科，中山 528400 2廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808

環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear與傳統(tǒng)試劑在組織處理后HE染色及FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因中的比較*

陳志強(qiáng)1， 王 瑩1△， 葉才果2， 米賢軍1， 陳 昂1， 鐘守軍1，黃華勇1， 徐秀梅1， 代新珍1， 鄧文同1， 劉超凡1

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院病理科，中山 5284002廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808

目的 比較環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear和二甲苯透明脫蠟制作的組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色優(yōu)良率，對(duì)比熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)2種透明脫蠟液制作的乳腺癌組織切片的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)基因擴(kuò)增陽性率，探討Van-Clear替代二甲苯的可行性。方法 收集中山市博愛醫(yī)院2013年2月～2015年12月門診及住院部送檢的乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本89例、乳腺增生標(biāo)本125例、子宮平滑肌瘤標(biāo)本193例、子宮平滑肌肉瘤標(biāo)本12例、肺癌穿刺標(biāo)本16例、絨毛標(biāo)本139例，同一病變部位切取2個(gè)樣本，用抽簽法隨機(jī)分為2組，命名為A、B組。A組采用二甲苯透明脫蠟制作切片574張；B采用Van-Clear透明脫蠟制作切片574張。依據(jù)切片染色情況判定切片等級(jí)，采用SPSS 20.0軟件比較A、B組切片HE染色優(yōu)良率；A、B組中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本再各制作切片89張，采用SPSS 20.0軟件比較FISH法檢測(cè)的HER2基因擴(kuò)增的差異。結(jié)果 ①生物顯微鏡下，A、B兩組切片HE染色結(jié)果細(xì)胞輪廓清晰、透明度好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映、色彩鮮艷，核質(zhì)對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見、分辨良好，分裂象染色體呈現(xiàn)黑藍(lán)色，各種成分層次分明。②A、B兩組切片HE染色優(yōu)良片分別為570張、572張，中等、差片4張、2張。染色優(yōu)良率分別為99.30%、99.65%，兩組間染色優(yōu)良率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.50，P>0.05)。③熒光顯微鏡下，A、B兩組切片乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2雙探針FISH檢測(cè)結(jié)果組織輪廓和背景均清晰，探針定位準(zhǔn)確，可見耀眼的紅/綠熒光信號(hào)。④A、B兩組切片檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌HER2基因，F(xiàn)ISH陽性率分別為24.72%、26.97%，兩組間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.50，P>0.05)，且FISH結(jié)果符合率為97.75%。結(jié)論 環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear有替代傳統(tǒng)試劑二甲苯應(yīng)用于組織切片HE染色及FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因的潛在可能。

環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear； 二甲苯； 組織切片； 蘇木精-伊紅染色； 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌； HER2基因； 熒光原位雜交

病理診斷至今仍然是臨床診斷中最重要的診斷。2015年國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)政醫(yī)管局頒布了病理學(xué)科的第一批質(zhì)控指標(biāo)，包含了蘇木精-伊紅(HE)切片的優(yōu)良率的過程性指標(biāo)[1]。只有一張好的HE切片，才能期許后續(xù)的免疫組織化學(xué)和分子檢測(cè)的準(zhǔn)確性，進(jìn)而保證病理診斷的準(zhǔn)確性。眾所周知，在HE切片制作及相關(guān)病理樣本檢測(cè)中，二甲苯是傳統(tǒng)的透明脫蠟液。二甲苯的透明脫蠟作用貫穿于組織處理、后續(xù)的HE染色及分子病理檢測(cè)整個(gè)過程。有研究[2]表明二甲苯具有潛在致癌性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直試圖在尋找其安全的替代品。Neghab等[3]研究表明把環(huán)保礦物油作為透明脫蠟液用于HE染色，實(shí)驗(yàn)取得了與傳統(tǒng)試劑二甲苯類似的良好染色效果。張進(jìn)華等[4]應(yīng)用GS環(huán)保試劑制作的石蠟切片提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)擴(kuò)增，結(jié)果證實(shí)GS液與常規(guī)試劑一樣均能較好地保存組織中的DNA。

本研究所用Van-Clear是一種從桔皮或其他植物中提取的、不含芳香族化合物、性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)人體無危害的生物透明脫蠟液。研究旨在通過比較Van-Clear與二甲苯制作的組織切片HE染色優(yōu)良率，比較熒光原位雜交(FISH)法檢測(cè)兩者制作的乳腺癌組織切片的人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)基因擴(kuò)增陽性率，探討Van-Clear環(huán)保透明脫蠟液替代傳統(tǒng)透明脫蠟液二甲苯的可行性，為HE染色、FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因找到環(huán)保試劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑及儀器 Van-Clear環(huán)保透明脫蠟劑購(gòu)自華爍科技股份有限公司葛店分公司。生產(chǎn)企業(yè)許可證號(hào)：鄂食藥監(jiān)械生產(chǎn)登20130115號(hào)(更)，注冊(cè)證號(hào)：鄂(鄂州)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第1400006號(hào)(更)。蘇木精染液(哈瑞氏)、伊紅染液(醇溶性)由中國(guó)上海宏茲實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動(dòng)染色機(jī)均為日本櫻花檢驗(yàn)儀器株式會(huì)社生產(chǎn)。Thermo HM325輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)為德國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，切片厚度4～5 μm。DM3000生物顯微鏡由德國(guó)徠卡公司生產(chǎn)。尼康ECLIPSE 80i熒光顯微鏡日本奧林巴斯株式會(huì)社生產(chǎn)。HER2探針由中國(guó)北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供，為GLP HER2/CSP17探針。S500-24熒光原位雜交儀為美國(guó)Thermobrit公司生產(chǎn)。

1.1.2 標(biāo)本來源 選取中山市博愛醫(yī)院2013年2月～2015年12月門診及住院部送檢的各種組織標(biāo)本574例。其中大標(biāo)本：乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌標(biāo)本89例、乳腺增生標(biāo)本125例、子宮平滑肌瘤標(biāo)本193例、子宮平滑肌肉瘤標(biāo)本12例、絨毛標(biāo)本139例，同一病變部位各取材2塊，組織按照標(biāo)準(zhǔn)取材大小(1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm)切取。小標(biāo)本：肺癌穿刺標(biāo)本16例，同一病變部位各取材2塊，按照長(zhǎng)1.0 cm，直徑0.1 cm大小切取。89例乳腺癌患者均為女性，年齡36.3～78.2歲，平均(51.9±2.8)歲。術(shù)前未行任何輔助治療(內(nèi)分泌治療、放療、化療)，病理診斷均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，各標(biāo)本均見明顯的腫瘤。每例標(biāo)本的2塊組織用抽簽法隨機(jī)分為2組，命名為A、B組。A組采用二甲苯透明脫蠟制作切片；B采用Van-Clear透明脫蠟制作切片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

組織處理：組織固定、取材后在全自動(dòng)組織脫水機(jī)中進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟等處理。組織取材前后的固定均用4%中性緩沖甲醛，梯度乙醇脫水、根據(jù)A、B組的不同分別用二甲苯和Van-Clear透明、石蠟浸蠟，相關(guān)病理組織處理流程和時(shí)間按中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)會(huì)病理技術(shù)相關(guān)規(guī)程在全自動(dòng)組織脫水機(jī)中進(jìn)行[5]，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm厚切片，裱片于防脫片載玻片上。

1.2.1 傳統(tǒng)HE染色 A、B兩組切片烤片后分別用二甲苯和Van-Clear脫蠟至水，梯度乙醇洗滌，流水洗，蘇木精染色，流水洗，鹽酸乙醇分化，流水洗，氨水返藍(lán)，流水洗，醇溶性伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯和Van-Clear分別透明，中性樹膠封固。HE染色流程和時(shí)間按中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)會(huì)病理技術(shù)相關(guān)規(guī)程在全自動(dòng)染色機(jī)中進(jìn)行[6]。

1.2.2 HE染色切片評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 染色理想的切片HE染色在顯微鏡下應(yīng)是：細(xì)胞輪廓清晰、透明度好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)應(yīng)藍(lán)紅相映、色彩鮮艷，核質(zhì)對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見、分辨良好，同一切片中紅細(xì)胞、肌纖維、膠原纖維的伊紅著色層次能區(qū)分[7]。對(duì)常規(guī)病理切片HE染色結(jié)果的評(píng)定依據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]推薦的質(zhì)控評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①優(yōu)質(zhì)，細(xì)胞輪廓清晰、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)比清晰、分辨良好、透明度好、同一切片中各種成分層次分明；②優(yōu)良，切片中所有組織染色、透明度較好，但有些背景；③中等，切片中所有組織染色、透明度差普遍較弱，或出現(xiàn)大量背景；④差，測(cè)試片中所有組織染色、透明度差非常弱，或根本不染色。

1.2.3 乳腺癌HER2基因相關(guān)操作及結(jié)果判讀 玻片預(yù)處理后放入65℃恒溫箱烤片過夜，Van-Clear或二甲苯脫蠟后，依次室溫置于100%、85%、70%的乙醇各2 min、50℃下用30%(W/V)酸性亞硫酸鈉處理組織切片20～30 min。室溫下氯化鈉檸檬酸鈉緩沖液(SSC)漂洗，胃蛋白酶K消化，于2×SSC溶液中漂洗，室溫下將組織切片玻片依次置于梯度乙醇脫水，加熱玻片至56 ℃。玻片和探針混合液，在70%(V/V)的甲酰胺/2×SSC變性液中，72℃～74℃下變性5 min，-20℃預(yù)冷的70%、85%和100%乙醇梯度脫水各3 min，玻片自然干燥，置于45～50 ℃烤片機(jī)上預(yù)熱2～5 min后與探針雜交。將變性后的探針混合液10 μL滴于玻片雜交區(qū)域，將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃保溫箱中過夜雜交。將玻片置于3瓶50%(V/V)甲酰胺溶液中各漂洗10 min，將玻片置于2×SSC溶液中，漂洗10 min，將玻片置于0.1%(V/V)NP-40/2×SSC溶液中，漂洗5 min，將玻片室溫浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min。干燥后滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封固，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 FISH結(jié)果判讀 判讀標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，我們重點(diǎn)關(guān)注環(huán)保試劑使用后是否影響細(xì)胞核的完整性、信號(hào)強(qiáng)度以及背景信號(hào)雜點(diǎn)的干擾等技術(shù)問題。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

HE染色切片優(yōu)良率、FISH結(jié)果陽性率的差異比較均用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HE染色優(yōu)良率是指HE染色優(yōu)良和優(yōu)質(zhì)切片數(shù)占同期HE染色切片總數(shù)的比例[12]。FISH結(jié)果陽性率是指FISH結(jié)果陽性占同期FISH結(jié)果總數(shù)的比例。FISH結(jié)果的符合率定義為以A組實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果為參照，B組實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果與其符合的情況。

2 結(jié)果

2.1 組織切片HE染色生物顯微鏡下的觀察

A、B兩組切片細(xì)胞輪廓清晰、透明度好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映、色彩鮮艷，核質(zhì)對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見、分辨良好，分裂象染色體呈現(xiàn)黑藍(lán)色，各種成分層次分明(圖1)。

A：A組細(xì)支氣管肺泡癌，非黏液性，腫瘤細(xì)胞沿尚存的肺泡壁生長(zhǎng)(×100)；B：B組細(xì)支氣管肺泡癌，非黏液性，腫瘤細(xì)胞沿尚存的肺泡壁生長(zhǎng)(×100)；C：A組子宮平滑肌肉瘤，腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞核的多形性，并且容易找到核分裂象(×400)；D：B組子宮平滑肌肉瘤，腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞核的多形性，并且容易找到核分裂象(×400)圖1 兩組組織切片HE染色效果比較Fig.1 Results of HE staining in group A and B

2.2 組織切片HE染色優(yōu)良率

A、B兩組切片HE染色優(yōu)質(zhì)、優(yōu)良片和中等、差片及染色優(yōu)良率結(jié)果見表1?？梢姡瑑山M間染色優(yōu)良率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明環(huán)保試劑并不差于傳統(tǒng)試劑。

2.3 FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因熒光顯微鏡觀察

熒光顯微鏡下，A、B兩組切片組織輪廓和背景均清晰，探針定位準(zhǔn)確，可見耀眼的紅/綠熒光信號(hào)(圖2)。綠色為CSP17信號(hào)數(shù)，紅色為HER2信號(hào)數(shù)，藍(lán)色為細(xì)胞核。

表1 A、B組切片HE染色優(yōu)良率Table 1 Comparison of HE staining quality between group A and group B

A：A組浸潤(rùn)性乳腺癌HER2基因FISH陰性，HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0；B：B組浸潤(rùn)性乳腺癌HER2基因FISH陰性，HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0；C：A組浸潤(rùn)性乳腺癌HER2基因FISH陽性，HER2/CSP17比值≥2.0；D：B組浸潤(rùn)性乳腺癌HER2基因FISH陽性，HER2/CSP17比值≥2.0圖2 浸潤(rùn)性乳腺癌HER2基因DNA雙色FISH圖像(×1 000)Fig.2 Bicolor FISH images of HER2 genes of invasive breast cancer tissues(×1 000)

2.4 FISH法檢測(cè)乳腺癌HER2基因陽性率

A、B兩組乳腺癌組織切片HER2基因陽性率檢測(cè)結(jié)果見表2，可見兩組間HER2基因陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且FISH檢測(cè)結(jié)果符合率高達(dá)97.75%，說明環(huán)保試劑與傳統(tǒng)試劑一致性好。

表2 A、B組乳腺癌組織切片HER2基因陽性率Table 2 Positive rate of HER2 genes in breast cancer tissue sections of group A and B

3 討論

隨著人類基因組研究的進(jìn)展，人們對(duì)疾病的病理診斷也從依靠高質(zhì)量HE切片的形態(tài)學(xué)深入到其發(fā)生發(fā)展的分子水平。前者是進(jìn)行腫瘤組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)最原始的依據(jù)、臨床病理診斷的基礎(chǔ)；后者是分子特征的揭示，不僅有助于提高診斷的準(zhǔn)確率，更有助于腫瘤醫(yī)師及時(shí)有效地采取相應(yīng)的臨床措施[13]。

為了使石蠟?zāi)軌蚪氲浇M織塊內(nèi)，必須經(jīng)過一種既能與脫水劑混合，又能與石蠟相溶的媒介物質(zhì)，通過這種溶劑的媒介作用，而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。HE染色過程中當(dāng)組織中的水分全部被該溶劑取代時(shí)，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。這一過程稱為透明，該溶劑稱為透明劑[14]。眾所周知，無論是經(jīng)典的切片HE染色還是新興的分子病理技術(shù)FISH，脫蠟都是必不可少的環(huán)節(jié)。石蠟切片的HE染色必須先用一種溶劑脫去切片中的石蠟，以使染料易于進(jìn)入細(xì)胞和組織，這一過程稱為脫蠟，該溶劑稱為脫蠟劑[14]。FISH技術(shù)也需要脫去切片中的石蠟以使探針易于進(jìn)入細(xì)胞和組織。

在石蠟包埋的樣品中，二甲苯傳統(tǒng)上被大量用于組織處理和染色，但有研究顯示長(zhǎng)期暴露于二甲苯，會(huì)對(duì)呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟系統(tǒng)造成健康危害[15-19]，因此尋找一個(gè)更安全的替代品以擺脫二甲苯毒性對(duì)病理學(xué)從業(yè)人員的健康威脅已變得迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)研究正是為解決此問題的。

透明脫蠟的作用機(jī)制是“相似相溶規(guī)律”：結(jié)構(gòu)相似、分子間作用力的類型和極性相近的兩種物質(zhì)彼此更易互溶。二甲苯為無色透明有特殊氣味的液體，是由間二甲苯、對(duì)二甲苯和鄰二甲苯組成的芳香烴。石蠟是固態(tài)高級(jí)烷烴的混合物，主要為直鏈烷烴，還有少量帶個(gè)別支鏈的烷烴和帶長(zhǎng)側(cè)鏈的單環(huán)環(huán)烷烴。Van-Clear是從桔皮或其他植物中提取，分子式為CnH2n+2(n為8～12)，分子量為114～170的飽和直鏈烷烴混合物，是一種無色無味無毒的液體。與二甲苯的苯環(huán)的“彎”相比，Van-Clear的直鏈烷烴更“直”，與同是直鏈烷烴的石蠟結(jié)構(gòu)更為相似，所以分子間結(jié)合得更緊，溶解度更大。

從圖1可見2種透明脫蠟液在A、B組切片HE染色放大100～400倍生物顯微鏡下的效果：兩組切片細(xì)胞輪廓清晰、透明度好，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映、色彩鮮艷，核質(zhì)對(duì)比明顯，核膜及核染色質(zhì)顆粒清晰可見、分辨良好，分裂象染色體呈現(xiàn)黑藍(lán)色，各種成分層次分明。這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)保透明脫蠟液制作的石蠟切片在常規(guī)病理組織制片及染色中無差異相符[20-21]。鹿偉等[20]研究的是環(huán)保組織固定脫水系列套裝試劑在標(biāo)本處理中的使用，未涉及后續(xù)HE染色中的應(yīng)用。郭寶強(qiáng)等[21]研究的是環(huán)保型GS套裝染液試劑與傳統(tǒng)含有二甲苯的HE染液進(jìn)行染色對(duì)比，未涉及前面的標(biāo)本處理的使用。而本研究所用的環(huán)保透明脫蠟液從標(biāo)本的處理到組織染色過程均涉及使用，保證了整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的環(huán)保性、試劑使用的簡(jiǎn)便性。實(shí)驗(yàn)樣本量更大，還對(duì)2種試劑制作切片HE染色的優(yōu)良率差異做了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從多角度保證了研究的嚴(yán)謹(jǐn)性與可信度。本研究涉及送檢病理科的各種標(biāo)本，常見標(biāo)本如子宮平滑肌瘤、少見組織如子宮平滑肌肉瘤；大標(biāo)本如乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、小標(biāo)本如肺癌穿刺；質(zhì)地致密、韌性大的標(biāo)本如子宮平滑肌瘤，質(zhì)地疏松、韌性小的標(biāo)本如絨毛；良性增生非腫瘤組織如乳腺增生、惡性增生腫瘤組織如乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌這種對(duì)組織處理、HE染色質(zhì)量要求高的組織，從表1可知兩組切片間HE染色優(yōu)良率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且兩組切片HE染色優(yōu)良率在99.30%～99.65%，符合三甲醫(yī)院常規(guī)石蠟包埋-HE染色切片的優(yōu)良率>98%的要求[9]。

從圖2可見2種透明脫蠟液在FISH法檢測(cè)A、B組乳腺癌切片的HER2基因放大1 000倍熒光顯微鏡下效果：兩組切片組織輪廓和背景均清晰，細(xì)胞核完整，探針定位準(zhǔn)確，可見耀眼的紅/綠熒光信號(hào)，無背景信號(hào)雜點(diǎn)的干擾。此現(xiàn)象與時(shí)姍姍等[22]報(bào)道環(huán)保型透明脫蠟液與傳統(tǒng)二甲苯處理的組織切片在FISH分子病理檢測(cè)中的效果并無明顯差異相一致。時(shí)姍姍等[22]研究的是5例乳腺癌HER2基因及5例肺癌EGFR基因，而本研究針對(duì)樣本量更大的乳腺癌HER2基因進(jìn)行了FISH陽性率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從表2可知兩組切片間FISH檢測(cè)結(jié)果符合率高、FISH陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組乳腺癌切片HER2基因FISH陽性率為24.72%、26.97%。與Rosa等[23]研究證實(shí)人HER2在20%～30%的原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌中有基因擴(kuò)增和蛋白的過表達(dá)相符。與劉秋雨等[24]報(bào)道的44例乳腺癌熒光原位雜交檢測(cè)HER2基因，陽性10例，陽性率為23%，基本上一致。

本研究以乳腺癌等各種病理科標(biāo)本為對(duì)象，通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，提示環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear的透明脫蠟效果滿意，既可用于組織制片后HE染色，也可用于HER2基因檢測(cè)時(shí)FISH組織切片的透明脫蠟，可望替代傳統(tǒng)的透明脫蠟液二甲苯。作者推測(cè)根據(jù)相似相溶規(guī)律，Van-Clear的直鏈烷烴與石蠟組織極為相似，因此，其與石蠟的分子間結(jié)合得更緊密，更易互溶，為HE染液進(jìn)入細(xì)胞和組織、FISH法檢測(cè)乳腺癌人HER2基因中雙探針進(jìn)入細(xì)胞和組織提供了更為有利的條件，因此實(shí)驗(yàn)研究效果并不差于傳統(tǒng)試劑二甲苯。

綜上所述，應(yīng)用環(huán)保透明脫蠟液Van-Clear減少了傳統(tǒng)試劑二甲苯對(duì)環(huán)境與人體的危害，改用新型環(huán)保透明脫蠟液具有環(huán)保價(jià)值與臨床工作的實(shí)際意義。然而迄今為止，因在質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)化、成本價(jià)格、毒力試驗(yàn)等方面原因，目前國(guó)內(nèi)仍處于研究實(shí)驗(yàn)狀態(tài)，未全面應(yīng)用于日常病理檢測(cè)工作中。本研究HE染色組織形態(tài)雖好，但并未囊括病理科所有種類標(biāo)本的透明脫蠟染色，作為一種新型環(huán)保試劑問世時(shí)間短，遠(yuǎn)期效果還有待多種組織大樣本量的驗(yàn)證。本研究FISH檢測(cè)乳腺癌HER2基因效果雖佳，與傳統(tǒng)試劑相比較陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但到底以哪個(gè)陽性率為準(zhǔn)會(huì)對(duì)后期指導(dǎo)個(gè)體化治療產(chǎn)生不同的后果。如果結(jié)合檢測(cè)同一標(biāo)本使用2種透明脫蠟液的HER2的免疫組化染色，以初步確定不同的陽性率是Van-Clear透明脫蠟產(chǎn)生的假陽性，還是二甲苯產(chǎn)生的假陰性又或者通過多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)排除手工操作存在差異的可能，以還原實(shí)驗(yàn)的真實(shí)結(jié)果，相信疑惑將會(huì)迎刃而解。另外，Van-Clear作為環(huán)保產(chǎn)品在免疫組織化學(xué)染色(IHC)、突變分析等分子檢測(cè)的使用效果有待在大樣本、多病種中去摸索研究才能廣泛應(yīng)用于臨床病理研究中。

[1] 陳杰.質(zhì)量永遠(yuǎn)是病理診斷的生命線[J].中華病理學(xué)雜志，2016，45(1)：1-2.

[2] Premalatha B R，Patil S，Rao R S，et a1.Mineral oil-a biofriendly substitute for xylene in depar-affinization：a novel method[J].J Contemp Dent Pract，2013，14(2)：281-286.

[3] Neghab M，Hosseinzadeh K，Hassanzadeh J.Early liver and kidney dysfunction associated with occupational exposure to sub-threshold limit value levels of benzene，toluene，and xylenes in unleaded petrol[J].Saf Health Work，2015，6(4)：312-316.

[4] 張進(jìn)華，肖莎，李顯箏，等.比較GS環(huán)保試劑與常規(guī)試劑制備的組織樣本在熒光定量PCR中的效果[J].診斷病理學(xué)雜志，2011，18(4)：33.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012：33.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012：37-38.

[7] 楊月紅，袁靜萍，文登虎，等.三種類型的蘇木精在HE染色中的效果比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31(3)：345-346.

[8] Ankle M R，Joshi P S.A study to evaluate the efficacy of xylene-free hematoxylin and eosin staining procedure as compared to the conventional hematoxylin and eosin staining：an experimental study[J].J Oral Maxillofac Pathol，2011，15(2)：161-167.

[9] 中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2012：6.

[10] 乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2014版)編寫組.乳腺癌HER2檢測(cè)指南(2014版)[J].中華病理學(xué)雜志，2014，43(4)：262-267.

[11] Wolff A C，Hammond M E，Hicks D G，et a1.Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer：american society of clinical oncology/college of american pathologists clinical practice guideline update[J].J Clin Oncol，2013，31(31)：3997-4013.

[12] 王銀萍.病理專業(yè)醫(yī)療質(zhì)量控制指標(biāo)(2015年版)的解讀[J].中華病理學(xué)雜志，2015，44(11)：830-832.

[13] Liu H，Lu J，Hua Y，et a1.Targeting heat-shock protein 90 with ganetespib for molecularly targeted therapy of gastric cancer[J].Cell Death Dis，2015，6(1)：e1595.

[14] 來茂德，主編.病理學(xué)高級(jí)教程[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2013：746-750.

[15] Niaz K，Bahadar H，Maqbool F，et al.A review of environmental and occupational exposure to xylene and its health concerns[J].Excli J，2015，23(14)：1167-1186.

[16] Marchand A，Aranda-Rodriguez R，Tardif R，et al.Human inhalation exposures to toluene，ethylbenzene，and mxylene and physiologically based pharmacokinetic modeling of exposure biomarkers in exhaled air，blood and urine[J].Toxicol Sci,2015，144(2)：414-424.

[17] Edokpolo B，Yu Q J，Connell D.Health risk assessment of ambient air concentrations of benzene，to luene and xylene(BTX)in service station environments[J].Int J Environ Res Public Health,2014，11(6)：3654-3674.

[18] Li P，Wu H，Li Q，et al.Brominated flame retardants in food and environmental samples from a production area in China：concentrations and human exposure assessment[J].Environ Monit Assess，2015，187(11)：1-11.

[19] 陶麗君，張俊鋒，馮鼎，等.某公司新建甲苯回收項(xiàng)目中苯和甲苯及二甲苯的監(jiān)測(cè)[J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2012，30(7)：546-547.

[20] 鹿偉，董賀.環(huán)保組織固定脫水系列套裝試劑在病理技術(shù)中的應(yīng)用[J].診斷病理學(xué)雜志，2012，19(2)：160.

[21] 郭寶強(qiáng)，竇文聰，郭影芳，等.環(huán)保型病理GS染色套液與傳統(tǒng)HE染液的比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013， 29(11)：1264-1266.

[22] 時(shí)姍姍，余波，馬恒輝，等.在分子病理檢測(cè)中環(huán)保透明脫蠟液與二甲苯應(yīng)用的比較[J].診斷病理學(xué)雜志，2013，20(12)：794-795.

[23] Rosa F E，Santos R M，Rogatto S R，et al.Chromogenicinsituhybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas[J].Braz J Med Biol Res，2013，46(3)：207-216.

[24] 劉秋雨，孔令非，劉正國(guó).乳腺癌HER2基因檢測(cè)的臨床價(jià)值[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志，2010，24(8)：778-780.

(2016-06-13 收稿)

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Comparison of Tissue Dewaxing by Environment-friendly Transparent Dewaxing Solution Van-Clear and Conventional Reagents for HE Staining and Detection of HER2 Genes by FISH in Breast Cancer Tissues

Chen Zhiqiang1，Wang Ying1△，Ye Caiguo2etal

1Department of Pathology，Zhongshan Bo’ai Hospital Affiliated to Southern Medical University，Zhongshan 528400，China2Key Laboratory of Medical Molecular Diagnosis，Guangdong Province Affiliated to Guangdong Medical University，Dongguan 523808，China

Objective To compare HE staining after tissue dewaxing by environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear and conventional reagents，and compare positive rate of human epidermal growth factor receptor-2(HER2)gene amplification byinsituhybridization(FISH)assay in breast cancer tissue sections after the two dewaxing methods，and further explore the feasibility of Van-Clear replacing xylene.Methods Totally，89 cases of infiltrating ductal breast carcinoma，125 cases of hyperplasia of mammary glands，193 cases of leiomyoma of uterus，12 cases of leiomyosarcoma of uterus，16 cases of lung cancer，and 139 cases of villus specimens submitted by the outpatient and inpatient departments in Zhongshan Bo’ai Hosipital were all collected from February 2013 to December 2015.Two samples were taken from the same lesion site，and randomly assigned to group A and B.Group A used xylene dewaxing to make 574 slices，while group B used Van-Clear transparent dewaxing to make 574 slices.The slices were graded according to staining levels.Good HE staining rate was compared between group A and B by using SPSS 20.0.Eighty-nine sections from breast infiltrating ductal carcinoma tissues in group A and B were prepared.Difference in HER2 gene amplification detected by FISH was compared between the two groups.Results ①Under the biological microscope，the HE staining results of the sections in group A and B were as follows：The cells had clear outline and good transparency.Their nucleus and cytoplasm had bright colors such as blue and red.The nucleoplasm had obvious contrast.The nuclear membrane and nuclear staining granules were clearly visible and well resolved.The mitotic chromosome was dark blue with distinct components and gradations.②In group A and B，the number of the HE staining slides of different quality was as follows，high quality：468 and 476，fine quality：102 and 96，medium quality：4 and 2，bad quality，0 and 0，respectively.The good staining rate was 99.30% and 99.65% in group A and B，respectively(χ2=0.50，P>0.05).③Under the fluorescence microscope，the detection results of HER2 genes in infiltrating ductal breast carcinoma specimens by using dual probe FISH technique were as follows：The tissue profile and the background were both clear；the probe was accurate；and the red/green fluorescence signals were visible.④ HER2 genes in the infiltrating ductal breast carcinoma specimens were detected，and the positive rate of FISH was 24.72% and 26.97%，respectively(χ2=0.50，P>0.05).Besides，the coincidence rate of FISH result was 97.75%.Conclusion The environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear has the potential to replace the conventional reagent xylene in the application of the HE staining and the use of FISH technique to detect HER2 genes in the breast cancer after both tissue processed.

environment-friendly transparent dewaxing solution Van-Clear； xylene； tissue section； hematoxylin eosin staining； infiltrating ductal breast carcinoma； HER2 gene； fluorescenceinsituhybridization

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81572782)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項(xiàng)課題(No.A2017321)； 廣東省中山市衛(wèi)生和計(jì)劃生育局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)課題(No.2014J128)

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.016

陳志強(qiáng)，男，1981年生，副主任技師，E-mail：765228687@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：334234558@qq.com