薛曉偉　李星奇　王德田*

經(jīng)溶劑回收儀再生的二甲苯在快速冷凍病理中的染色效果研究

薛曉偉①李星奇①王德田①*

目的：對使用CBG BIOTECH溶劑回收儀再生的二甲苯與新開封二甲苯在手術(shù)快速冷凍病理中的染色效果進行比較。方法：選取40例測試病理組織，OCT包埋后制作冷凍切片2張，分別使用再生和新開封二甲苯進行染色處理，就其染色后的組織結(jié)構(gòu)、細胞核及細胞質(zhì)的染色情況進行評分。結(jié)果：在快速冷凍病理中再生二甲苯與新開封的二甲苯在組織結(jié)構(gòu)細胞核染色以及細胞質(zhì)染色評分相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)。結(jié)論：再生的二甲苯可以應(yīng)用于快速冷凍病理的HE染色法染色。

二甲苯；回收；HE染色法；快速冷凍病理；CBG BIOTECH溶劑回收儀

[First-author’s address] Department of Pathology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100730, China.二甲苯為無色透明液體，具有一定的毒性，但因其價格低廉，透明效果好，是病理科常用的試劑之一[1-2]。由于脫水透明的過程中不可避免地存在液體攜帶與損耗，為保證染色質(zhì)量，需要根據(jù)切片的負荷量等因素定期更換二甲苯，由此在廢液處理過程中會對環(huán)境造成二次污染[3]。因此，實現(xiàn)二甲苯重復(fù)回收使用，不僅可有效地節(jié)約購買試劑的成本更重要的是保護環(huán)境，避免試劑的二次污染。然而，經(jīng)回收后重復(fù)利用的二甲苯其應(yīng)用效果是否能滿足病理診斷的需要仍需加以考證[4-5]。尤其是再生二甲苯在術(shù)中快速冷凍病理中的應(yīng)用效果尚未進行評價，故本研究對再生二甲苯與新開封二甲苯在術(shù)中快速冷凍病理中的染色效果進行比較。

1　材料與方法

1.1標本采集

收集2015年6-10月北京協(xié)和醫(yī)院冷凍病理術(shù)后未經(jīng)固定的40例患者手術(shù)標本，包括乳腺、肺、甲狀腺、腎臟、膽囊以及子宮標本。標本類型涉及乳腺纖維腺瘤、乳腺腺病、肺腺癌、甲狀腺腺瘤、腎透明細胞癌和腎囊腫、膽囊息肉及子宮肌瘤等，測試組織的來源及數(shù)量如表1所示。

表1　測試組織的來源及數(shù)量

將40例病理測試組織經(jīng)OCT包埋后，冷凍切片機切成6～8 μm的切片2張，固定后分別使用再生二甲苯組和新開封二甲苯組進行染色。所有測試標本均為術(shù)中快速病理診斷完成后不影響冰余常規(guī)診斷的剩余組織，制作成1 cm×1 cm×0.3 cm的組織塊，避免脂肪及壞死組織。

1.2儀器及試劑

采用CM3050 S冷凍切片機(德國，徠卡)；CBG BIDTECH立式溶劑回收儀(美國)；Aperio數(shù)字病理掃描儀與分析系統(tǒng)(德國，徠卡)；AX10共覽顯微鏡(德國，蔡司)。試劑采用冷凍包埋劑OCT(德國，徠卡)；冷凍固定液、蘇木素染液、伊紅染液、分化液以及返藍液(北京九州柏林生物有限公司)；無水乙醇，新開封二甲苯(國藥集團)。

1.3回收二甲苯

開啟回收儀的電源并抽吸10 L廢二甲苯至處理桶內(nèi)→選擇程序“處理二甲苯(XYLENEMODE)”→進行再生→回收后的二甲苯會流入接收瓶內(nèi)，廢液入廢液桶。

1.4二甲苯純度測定

使用CBG BIOTECH醫(yī)用酒精二甲苯立式回收儀的測試程序?qū)λ厥盏亩妆竭M行純度測試。在100 ml的量筒中加入85 ml的再生二甲苯，后加入去離子水補齊至100 ml，蓋好量筒的蓋子倒轉(zhuǎn)混合物，至分離點液面平穩(wěn)后讀數(shù)a。已再生二甲苯的純度計算為公式1：

1.5染色流程及評分

(1)切片經(jīng)冷凍固定液固定—自來水沖洗—蘇木素染色—自來水洗—分化—返藍—伊紅染色—自來水洗—梯度酒精脫水——分別使用再生二甲苯和新開封二甲苯進行透明—中性樹膠封片。

(2)采用隨機數(shù)字表分法在病理診斷醫(yī)師庫里抽取2名醫(yī)師就組織結(jié)構(gòu)染色、細胞質(zhì)的染色及細胞核的染色等3方面對切片的染色質(zhì)量進行單盲評分，得分范圍為0～3分：①0分，染色無法滿足診斷的需要；②1分，染色基本能滿足診斷的需要，但是效果較差；③2分，染色能夠滿足診斷的需要，效果一般；④3分，染色能夠滿足診斷的需要，效果較好[6]。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，對評分進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1再生二甲苯純度

根據(jù)二甲苯與水不相溶的特點，在測試量筒讀取二甲苯與水的分離點，運用純度公式(1)計算出再生二甲苯的純度穩(wěn)定在99.2%～99.5%之間，表明再生的二甲苯純度基本與新開封二甲苯的純度相似。

2.2染色效果

使用再生二甲苯和新開封二甲苯對測試組織冷凍切片進行透明染色，肉眼觀測染色效果，再生二甲苯使用HE染色法染色同樣可以獲得與新開封二甲苯一樣的效果，即切片組織完整，厚薄均勻，核漿分明，符合優(yōu)良片的標準[7-8]，如圖1所示。

圖1　新開封和再生二甲苯透明的冷凍切片HE染色圖(×100)

2.3染色評分

隨機抽取的病理醫(yī)師就2種處理的切片打分結(jié)果顯示，快速冷凍病理中再生二甲苯與新開封的二甲苯在組織結(jié)構(gòu)、細胞核染色以及細胞質(zhì)染色評分上相比均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.38，t=1.45，t=1.32；P＞0.05)，見表2。

表2　HE染色的評分情況比較

表2　HE染色的評分情況比較

組織結(jié)構(gòu)得分細胞核得分細胞質(zhì)得分新開封二甲苯2.36±0.292.48±0.282.50±0.29再生二甲苯2.37±0.312.49±0.312.44±0.31 t值1.381.451.32 P值0.780.820.20

3　討論

目前，術(shù)中快速病理診斷主要應(yīng)用冷凍切片，其質(zhì)量的好壞直接影響著手術(shù)方案的確定。因此，冷凍切片的HE染色法染色比常規(guī)石蠟切片具有更為苛刻的要求。

二甲苯作為冷凍切片染色過程中的透明試劑，切片在進入二甲苯前，其水分已經(jīng)完全被無水乙醇所替代，若二甲苯中含水，極易被組織吸收，封片時出現(xiàn)中性樹膠與水不相容的現(xiàn)象，導(dǎo)致組織“發(fā)霧”，影響切片質(zhì)量[9-11]。為保證冷凍切片的質(zhì)量，常常需要對二甲苯進行更換，除此之外，病理科在常規(guī)組織處理過程中也會產(chǎn)生大量的廢棄二甲苯液體，以往處理該廢液時，采取直接倒入廢液專道，或者交于環(huán)保部門集中處理，但是大多數(shù)情況下，這些有機溶劑會被焚燒或填埋，這樣廢溶劑不但得不到利用，還可能進入土壤以及大氣，造成環(huán)境二次污染。如何有效的處理這些廢棄液體，目前尚無國家或產(chǎn)業(yè)的統(tǒng)一規(guī)定，多數(shù)地區(qū)采取將病理科實驗室產(chǎn)生的廢棄液體按種類交由有資質(zhì)的廢液回收公司進行回收利用，這一做法雖然有效，但無形中增加了廢液循環(huán)過程中的經(jīng)濟成本[12]。因此，回收儀的出現(xiàn)可實現(xiàn)廢液的就地回收利用，有效地節(jié)約了處置廢液的成本，實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。

病理科產(chǎn)生的廢棄二甲苯中的主要雜質(zhì)是乙醇和石蠟，根據(jù)二甲苯沸點(137～140 ℃)與乙醇沸點(78.4 ℃)不同，設(shè)定加熱溫度，進行加熱，使低沸點組分蒸發(fā)，再冷凝以分離廢液組分，即可回收到清潔二甲苯溶劑。

本研究在冷凍切片的HE染色過程中使用再生二甲苯，進行染色測試實驗，切片染色評分也與傳統(tǒng)二甲苯評分無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異[13-14]；再生二甲苯可以重新應(yīng)用于術(shù)中快速冰凍病理的HE染色。同時，二甲苯的回收效率能夠達到90%以上，依次計算每年可以節(jié)約大量的二甲苯購置成本。

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The assessment of histomorphologic stain effect of recyled xylene for surgical frozen pathology

XUE Xiao-wei, LI Xing-qi, WANG De-tian// China Medical Equipment, 2016,13(11):136-138.

Objective: To investigate the quality of tissue morphology of fast frozen sections between the recycled xylene and the new xylene. Methods: Forty fresh specimens were embedded by OCT and were prepared into two equal sequence sections. With recycled xylene and new xylene stain processing, the haematoxylin and eosin (HE)-stained sections were evaluated for tissue structure, cellular and nuclear detail. Results: There were no significant differences in tissue morphology between recycled and new xylene, including tissue structure (t=1.38, P=0.78), nuclear (t=1.45, P=0.82) and cytoplasm (t=1.32, P=0.20) detail. Conclusion: Recycled xylene is suitable for HE staining in routine fast frozen sections.

Xylene; Recovery; Hematoxylin eosin staining; Fast frozen sections; CBG BIOTECH solvent recycler

薛曉偉,女,(1984- ),碩士，技師。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院病理科，從事病理技術(shù)工作。

1672-8270(2016)11-0136-03

R361

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.11.039

①中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院病理科 北京 100730

xiehewangdetian@126.com

2016-07-22