石 佳， 唐 晨， 呂紅彬

1四川省西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，瀘州 646000 2四川省德陽市人民醫(yī)院眼科，德陽 618000

實(shí)驗(yàn)研究

miR-15a對糖尿病性視網(wǎng)膜病變抗炎和抗新生血管生成的雙重調(diào)節(jié)作用*

石 佳1,2， 唐 晨2， 呂紅彬1△

1四川省西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，瀘州 6460002四川省德陽市人民醫(yī)院眼科，德陽 618000

目的 探討miR-15a對糖尿病性視網(wǎng)膜病變抗炎和抗新生血管生成的調(diào)節(jié)作用。方法 通過25 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株HARPE-19建立高糖模型(HG)，并以5 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的HARPE-19細(xì)胞作為對照(LG)，將HG組和LG組分為4個(gè)亞組：miR-15a mimic組、NC-mimic組、miR-15a inhibitor組和NC-inhibitor組，MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-15a與酸性鞘磷脂酶(ASM)的關(guān)系，RT-PCR檢測miR-15a、ASM、VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)。結(jié)果 NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組miR-15a表達(dá)均顯著低于LG組(均P<0.05)。miR-15a mimic組ASM mRNA表達(dá)水平顯著低于NC-mimic組(P<0.05)，miR-15a inhibitor組ASM mRNA表達(dá)水平顯著高于NC-inhibitor組(P<0.05)。miR-15a mimic組細(xì)胞遷移距離顯著大于NC-mimic組(P<0.05)，miR-15a inhibitor組細(xì)胞遷移距離顯著小于NC-inhibitor組(P<0.05)。轉(zhuǎn)染24～120 h，MTT法檢測miR-15a mimic組吸光度值顯著高于NC-mimic組(P<0.05)，miR-15a inhibitor組吸光度值顯著低于NC-inhibitor組(P<0.05)。NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著高于LG組(均P<0.05)。結(jié)論 降低miR-15a表達(dá)能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和血管新生，miR-15a通過炎癥反應(yīng)和血管生成雙重調(diào)節(jié)作用參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。

微小RNA； 糖尿病性視網(wǎng)膜病變； 炎癥反應(yīng)； 血管新生

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是中老年人群常見的致盲眼病之一[1]，流行病學(xué)調(diào)查顯示約有1/3的糖尿病患者存在糖尿病性視網(wǎng)膜病變體征，其中1/15出現(xiàn)影響視力的并發(fā)癥[2]。由于DR患者多發(fā)病于工作年齡，一旦喪失有用的視力，將會(huì)給家庭、社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。有研究證實(shí)[3]，促炎性因子和促血管生成因子能介導(dǎo)視網(wǎng)膜血管通透性增加和細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生病變。微小RNA(miRNA)是一種非編碼單鏈RNA分子，近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與多種細(xì)胞過程，包括分化、增殖、凋亡、代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。最新研究證實(shí)[4-5]，miRNA參與調(diào)節(jié)脂類、碳水化合物的代謝以及激活炎性通路，因此miRNA可能在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。miR-15a是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)的miRNA，Sun等[6]報(bào)道稱在高糖刺激的糖尿病環(huán)境下，miR-15a表達(dá)顯著降低。Spinetti等[7]也證實(shí)miR-15a過表達(dá)能夠阻斷Akt磷酸化途徑，抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用。本研究主要探討miR-15a對DR抗炎和抗新生血管生成的調(diào)節(jié)作用，旨在為DR的預(yù)防和治療提供新的作用靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及處理

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株HARPE-19(HRPE)購自美國菌種保藏中心(American type culture collection，ATCC)，HRPE細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，恒溫培養(yǎng)箱中以37℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞70%融合時(shí)，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，細(xì)胞以40%密度接種于6孔板，將HRPE細(xì)胞分為2組：高血糖組(HG)和低血糖組(LG)，HG組培養(yǎng)液中加入25 mmol/L葡萄糖，LG組培養(yǎng)液中加入5 mmol/L葡萄糖，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清購自廣州碧云天生物技術(shù)研究所。Trizol試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑盒、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM購自美國Invitrogen公司。miR-15a mimic/inhibitor特異性寡核苷酸序列及陰性對照均委托上海生工生物工程股份有限公司合成設(shè)計(jì)，miR-15a mimic：5′-AAACCGUUACCAUUACUGAGUUCUCAGUA-AUGGUAACGGUUUU-3′，陰性對照(NC-mimic)：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACG-UGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-15a inhibitor：5′-AACUCAGUAAUGGUAACGGUUU-3′，陰性對照(NC-inhibitor)：5′-UUGUACUACAA-AAGUACUG-3′。RNA提取試劑、SYBR-Premix ExTaqⅡ試劑盒、OligodT-Adaptor Primer、AMV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor購自寶生物工程(大連)有限公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HG組和LG組均分為4個(gè)亞組：miR-15a mimic組、NC-mimic組、miR-15a inhibitor組和NC-inhibitor組，細(xì)胞80%融合時(shí)，將細(xì)胞接種于24孔板，取100 nmol/L miR-15a mimic、NC-mimic、miR-15a inhibitor或NC-inhibitor，溶于100 μL無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(A液)靜置10 min，再取4 μL Lipofectamine 2000TM，溶于100 μL無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(B液)靜置5 min；關(guān)燈，于黑暗中將A液和B液混勻后室溫靜置10 min。將混合液加至培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。棄去轉(zhuǎn)染液，加入2 mL DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長完全融合時(shí)收集上清液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測miR-15a及ASM、VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，PBS沖洗3次，加入1 mL RNAiso，冰浴上靜置10 min，再加入1/4體積氯仿充分振蕩20 s，待溶液完全乳化后靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上層至EP管，再加入等體積異丙醇充分混勻，靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄去上清液，向沉淀中加入1 mL冷乙醇(75%)清洗沉淀。紫外分光光度計(jì)測定260 nm和280 nm處吸光度值，A260/A280>2.0說明RNA純度合格。取1 μL總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系：MgCl22 μL、RT Buffer 1 μL、dNTP 1 μL、RNase inhibitor 0.25 μL、OligodT-Adaptor Primer 0.5 μL、總RNA 1 μL、ddH2O 3.75 μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL。反應(yīng)條件：45℃ 10 min、50℃ 30 min、97℃ 5 min、5℃ 5 min。冰浴上配置PCR反應(yīng)體系：5×PCR緩沖液5 μL、ddH2O 14.35 μL、Primer 0.25 μL、RT反應(yīng)液0.15 μL、EX Taq HS 0.15 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后74℃延伸5 min。miR-15a內(nèi)參為U6，酸性鞘磷脂酶(ASM)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)內(nèi)參為β-actin；采用Lane ID圖像分析軟件分析產(chǎn)物并進(jìn)行半定量分析，目的基因表達(dá)水平以U6或β-actin作為參比。

1.5 MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別于細(xì)胞接種0、24、48、72、96、120 h時(shí)加入MTT試劑(20 μL/孔)，孵育4 h后再向每孔中加入150 μL DMSO，室溫下振蕩15 min，置于酶標(biāo)儀上檢測490 nm處吸光度(A)值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞生長能力。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞70%融合時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線(確保每孔至少有4條線穿過)，每孔鋪1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞80%融合時(shí)用無菌移液槍的槍頭在單層細(xì)胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次后，顯微鏡下測量劃痕的寬度，劃痕寬度=當(dāng)前劃痕寬度/初始劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-15a是否與ASM的3′-端非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)結(jié)合，實(shí)驗(yàn)操作簡述如下：細(xì)胞80%融合時(shí)，分別轉(zhuǎn)染100 ng 3′UTR克隆的鞘磷脂磷酸二酯酶-1(SMPD1)表達(dá)載體(ASM-3′UTR-WT)或3′UTR突變的SMPD1表達(dá)載體(ASM-3′UTR-MUT)，即miR-15a的結(jié)合部位5′-TGCTGCT-3′突變?yōu)?′-TGTGACT-3′；ASM-3′UTR-WT或ASM-3′UTR-MUT分別轉(zhuǎn)染至100 nmol/L miR-15a mimic細(xì)胞或NC-mimic細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的作為陰性對照。轉(zhuǎn)染24 h后用Dual-Luciferase Reporter Assay檢測熒光素酶的信號(hào)，所有操作均嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境誘導(dǎo)對細(xì)胞miR-15a、ASM mRNA表達(dá)的影響

分別轉(zhuǎn)染miR-15a mimic和miR-15a inhibitor后，miR-15a mimic組miR-15a表達(dá)水平顯著高于NC-mimic組(P<0.01，圖1A)，miR-15a inhibitor組miR-15a表達(dá)水平顯著低于NC-inhibitor組(P<0.01，圖1B)，證實(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組miR-15a表達(dá)均顯著低于LG組(均P<0.05，圖1A，1B)。進(jìn)一步分析顯示，miR-15a mimic組ASM mRNA表達(dá)水平顯著低于NC-mimic組(均P<0.01，圖1C)，miR-15a inhibitor組ASM mRNA表達(dá)水平顯著高于NC-inhibitor組(均P<0.01，圖1D)；在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組ASM mRNA表達(dá)均顯著高于LG組(均P<0.01，圖1C，1D)。

A：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后miR-15a表達(dá)；B：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后miR-15a表達(dá)；C：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后ASM mRNA表達(dá)；D：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后ASM mRNA表達(dá)；*P<0.05 **P<0.01圖1 各組細(xì)胞miR-15a、ASM mRNA表達(dá)水平Fig.1 Cell expression levels of miR-15a and ASM mRNA in different groups

2.2 miR-15a與ASM 3′UTR結(jié)合抑制ASM mRNA表達(dá)

ASM-3′UTR-WT+miR-15a mimic組熒光素酶活性顯著低于ASM-3′UTR-WT組、ASM-3′UTR-WT+NC-mimic組、ASM-3′UTR-MUT組、ASM-3′UTR-MUT+miR-15a mimic和ASM-3′UTR-MUT+NC-mimic組(均P<0.01，圖2)，證實(shí)miR-15a是與ASM mRNA的3′UTR結(jié)合發(fā)揮抑制ASM mRNA的作用。

2.3 細(xì)胞增殖與遷移能力

miR-15a mimic組細(xì)胞遷移距離顯著高于NC-mimic組(均P<0.01，圖3A)，miR-15a inhibitor組細(xì)胞遷移距離顯著低于NC-inhibitor組(均P<0.01，圖3B)；在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組細(xì)胞遷移距離均顯著低于LG組(均P<0.01，圖3A，3B)。轉(zhuǎn)染24～120 h，miR-15a mimic組吸光度值顯著高于NC-mimic組(均P<0.05，圖3C)，miR-15a inhibitor組吸光度值顯著低于NC-inhibitor組(均P<0.05，圖3D)；在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組吸光度值均顯著低于LG組(均P<0.05，圖3C，3D)。

1：ASM-3′UTR-WT；2：ASM-3′UTR-WT+miR-15a mimic；3：ASM-3′UTR-WT+NC-mimic；4：ASM-3′UTR-MUT；5：ASM-3′UTR-MUT+miR-15a mimic；6：ASM-3′UTR-MUT+NC-mimic;**P<0.01圖2 各組熒光素酶活性Fig.2 Luciferase activity in different groups

A：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后細(xì)胞遷移距離；B：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后細(xì)胞遷移距離；C：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后吸光度值；D：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后吸光度值；*P<0.05 **P<0.01圖3 各組細(xì)胞增殖與遷移能力Fig.3 Cell proliferation and migration capacity in different groups

2.4 miR-15a對VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-15a mimic組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著低于NC-mimic組(均P<0.05)，miR-15a inhibitor組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著高于NC-inhibitor組(均P<0.05)；在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著高于LG組(P<0.05，P<0.01)，見圖4。

3 討論

DR是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥，也是最常見的致盲原因之一。既往研究證實(shí)，血糖、血脂代謝異常與DR發(fā)病有關(guān)[8]。然而臨床上發(fā)現(xiàn)，即使血糖得到有效控制依然無法預(yù)防和控制DR發(fā)病，因此學(xué)者推測可能還有血糖、血脂異常之外的其他因素參與DR的發(fā)病[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，高血糖和血脂異常能激活多種信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎癥因子、促血管生成因子分泌增加，并促進(jìn)DR的發(fā)生和進(jìn)展。由于多數(shù)信號(hào)通路的激活與miRNA有關(guān)，因此miRNA可能是DR發(fā)病的潛在作用機(jī)制之一。目前已證實(shí)多種miRNA與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)，如miR-126和miR-195對炎癥因子的調(diào)節(jié)作用可能是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制之一[12-13]；高糖環(huán)境能夠下調(diào)miR-200b表達(dá)，并誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變。

A：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后VEGF mRNA表達(dá)；B：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后VEGF mRNA表達(dá)；C：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后IL-1β mRNA表達(dá)；D：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后IL-1β mRNA表達(dá)；E：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后IL-6 mRNA表達(dá)；F：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后IL-6 mRNA表達(dá)；G：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a mimic后TNF-α mRNA表達(dá)；H：低糖和高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染miR-15a inhibitor后TNF-α mRNA表達(dá)；*P<0.05 **P<0.01圖4 各組細(xì)胞VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)Fig.4 Cell expression levels of VEGF，IL-1β，IL-6，TNF-α mRNA in different groups

MiR-15a是近年來發(fā)現(xiàn)的一種與內(nèi)皮功能密切相關(guān)的miRNA。高血糖環(huán)境下，miR-15a表達(dá)明顯降低，提示miR-15a可能與糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor細(xì)胞中，HG組miR-15a表達(dá)均顯著低于LG組，說明高糖環(huán)境能夠抑制miR-15a的表達(dá)。Murray等[14]報(bào)道稱糖尿病視網(wǎng)膜酸性鞘磷脂酶(ASM)被激活，引起的鞘脂類代謝功能失調(diào)是導(dǎo)致DR炎癥反應(yīng)變化的重要代謝機(jī)制。內(nèi)皮細(xì)胞是ASM的主要來源。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，與正常視網(wǎng)膜細(xì)胞相比，糖尿病視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞ASM顯著升高。正常ASM水平在維持視網(wǎng)膜功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，ASM異常升高或降低均能導(dǎo)致一系列嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a mimic組ASM mRNA顯著降低，miR-15a inhibitor組ASM mRNA顯著升高；在NC-mimic細(xì)胞和NC-inhibitor組細(xì)胞中，HG組ASM mRNA表達(dá)均顯著高于LG組，說明高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)ASM表達(dá)，miR-15a過表達(dá)能夠抑制ASM表達(dá)。Dannhausen等[16]證實(shí)ASM能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)酰胺表達(dá)，并抑制細(xì)胞遷移和損傷修復(fù)功能。miRNA發(fā)揮作用有賴于與靶mRNA 3′UTR互補(bǔ)配對，抑制RNA分子翻譯、轉(zhuǎn)錄或?qū)е翿NA分子降解[17-18]。本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-15a與ASM的相互作用，結(jié)果顯示ASM-3′UTR-WT+miR-15a mimic組熒光素酶活性顯著降低，證實(shí)miR-15a是與ASM的3′UTR結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)ASM的作用。

生理情況下，血管生成有賴于促血管生成因子和抑制血管生成因子的平衡，當(dāng)2種因子的平衡被打破，則會(huì)誘導(dǎo)DR等病理性血管生成疾病。Yin等[19]報(bào)道稱miR-15a能夠抑制下肢缺血大鼠病理性血管形成，提示miR-15a可能參與新生血管形成過程。VEGF是重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，與新生血管密切相關(guān)。有報(bào)道稱[20]，ASM能夠促進(jìn)VEGF表達(dá)和遷移，導(dǎo)致血管通透性增加和血管新生。結(jié)合上述結(jié)果，提示miR-15a可能通過調(diào)節(jié)ASM代謝和VEGF的生成影響DR的發(fā)病。Guo等[21]也證實(shí)miR-15a能夠直接與VEGF的3′UTR端結(jié)合，拮抗DR血管生成的作用。TNF-α是廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞因子，與內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管新生密切相關(guān)。IL-1β、IL-6均可以加重血-視網(wǎng)膜屏障損傷，導(dǎo)致局部視網(wǎng)膜細(xì)胞浸潤、水腫和滲出。王超等[22]證實(shí)2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠視網(wǎng)膜組織和血液IL-1β、IL-6、TNF-α顯著高于正常小鼠，高糖和缺氧環(huán)境能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、相關(guān)炎癥因子釋放，導(dǎo)致視網(wǎng)膜黃斑水腫或增殖期DR。本研究顯示，miR-15a mimic組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)顯著降低，miR-15a inhibitor組VEGF、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高，說明miR-15a能夠抑制炎癥因子的合成與釋放，通過控制炎癥反應(yīng)抑制DR的發(fā)生和進(jìn)展。

綜上所述，降低miR-15a表達(dá)水平能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)和血管新生，miR-15a通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血管生成參與DR的發(fā)病過程。

[1] Mitsuhashi J，Morikawa S，Shimizu K，et al.Intravitreal injection of erythropoietin protects against retinal vascular regression at the early stage of diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Exp Eye Res，2012，106(16)：64-73.

[2] Scanlon P H，Aldington S J，Stratton I M.Delay in diabetic retinopathy screening increases the rate of detection of referable diabetic retinopathy[J].Diabet Med，2014，31(4)：439-442.

[3] Abu El-Asrar A M，Nawaz M I，Kangave D，et al.Angiogenesis regulatory factors in the vitreous from patients with proliferative diabetic retinopathy[J].Acta Diabetol，2013，50(4)：545-551.

[4] Kravchik M，Sunkar R，Damodharan S，et al.Global and local perturbation of the tomato microRNA pathway by a trans-activated DICER-LIKE 1 mutant[J].J Exp Bot，2013，65(2)：725-739.

[5] Cifuentes D，Xue H，Taylor D W，et al.A novel miRNA processing pathway independent of dicer requires argonaute 2 catalytic activity[J].Science，2010，328(5986)：1694-1698.

[6] Sun L L，Jiang B G，Li W T，et al.MicroRNA-15a positively regulates insulin synthesis by inhibiting uncoupling protein-2 expression[J].Diabetes Res Clin Pract，2011，91(1)：94-100.

[7] Spinetti G，F(xiàn)ortunato O，Caporali A，et al.MicroRNA-15a and micro RNA-16 impair human circulating proangiogenic cell functions and are increased in the proangiogenic cells and serum of patients with critical limb ischemia[J].Circ Res，2013，112(2)：707-715.

[8] Ola M S，Nawaz M I，Siddiquei M M，et al.Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic retinopathy[J].J Diabetes Complications，2012，26(1)：56-64.

[9] Santos J M，Tewari S，Kowluru R A.A compensatory mechanism protects retinal mitochondria from initial insult in diabetic retinopathy[J].Free Radic Biol Med，2012，53(9)：1729-1737.

[10] Mohammad G，Kowluru R A.Diabetic retinopathy and signaling mechanism for activation of matrix metalloproteinase-9[J].J Cell Physiol，2012，227(3)：1052-1061.

[11] 侯陽，劉學(xué)政，張克劍，等.視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病中的作用及其研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2010，50(42)：115-116.

[12] Mortuza R，F(xiàn)eng B，Chakrabarti S.miR-195 regulates SIRT1-mediated changes in diabetic retinopathy[J].Diabetologia，2014，57(5)：1037-1046.

[13] Mcauley A K，Dirani M，Wang J J，et al.A genetic variant regulating miR-126 is associated with sight threatening diabetic retinopathy[J].Diab Vasc Dis Res，2015，12(2)：133-138.

[14] Murray A R，Chen Q，Takahashi Y，et al.MicroRNA-200b downregulates oxidation resistance 1(Oxr1)expression in the retina of type 1 diabetes model[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(3)：1689-1697.

[15] da Silveira Dos Santos A X，Riezman I，Aguilera-Romero M A，et al.Systematic lipidomic analysis of yeast protein kinase and phosphatase mutants reveals novel insights into regulation of lipid homeostasis[J].Mol Biol Cell，2014，25(20)：3234-3246.

[16] Dannhausen K，Karlstetter M，Caramoy A，et al.Acid sphingomyelinase(aSMase)deficiency leads to abnormal microglia behavior and disturbed retinal function[J].Biochem Biophys Res Commun，2015，464(2)：434-440.

[17] Minguzzi S，Selcuklu S D，Spillane C，et al.An NTD-associated polymorphism in the 3′UTR of MTHFD1L can affect disease risk by altering miRNA binding[J].Hum Mutat，2014，35(1)：96-104.

[18] Kropiv?ek K，Pickford J，Carter D A.Postnataldynamics of Zeb2 expression in rat brain：analysis of novel 3′UTR sequence reveals a miR-9 interacting site[J].J Mol Neurosci，2014，52(1)：138-147.

[19] Yin K J，Olsen K，Hamblin M，et al.Vascular endothelial cell-specific microRNA-15a inhibits angiogenesis in hindlimb ischemia[J].J Biol Chem，2012，287(32)：27055-27064.

[20] Ito H，Tanaka K，Hagiwara K，et al.Transcriptional regulation of neutral sphingomyelinase 2 in all-trans retinoic acid-treated human breast cancer cell line，MCF-7[J].J Bio Chem，2012，151(6)：599-610.

[21] Guo S，Xu X，Tang Y，et al.miR-15a inhibits cell proliferation and epithelial to mesenchymal transition in pancreatic ductal adenocarcinoma by down-regulating Bmi-1 expression[J].Cancer Lett，2014，344(1)：40-46.

[22] 王超，邢邯英，王杏，等.通心絡(luò)膠囊對糖尿病視網(wǎng)膜病變KK/Upj-Ay小鼠血液及視網(wǎng)膜炎性因子表達(dá)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2014，17(27)：3264-3268.

(2017-01-13 收稿)

Anti-inflammatory and Anti-angiogenic Effect of miR-15a on Diabetic Retinopathy

Shi Jia1,2，Tang Chen2，Lv Hongbin1△

1Department of Ophthalmology，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China2Department of Ophthalmology，Deyang People’s Hospital of Sichuan Province，Deyang 618000，China

Objective To explore the anti-inflammatory and anti-angiogenic effect of miR-15a in diabetic retinopathy(DR).Methods High glucose model(HG)was established by treatment with 25 mmol/L glucose in human retinal pigment epithelial cell line HARPE-19，and HARPE-19 cells treated with 5 mmol/L glucose served as control(LG).HG group and LG group were divided into 4 subgroups：miR-15a mimic group，NC-mimic group，miR-15a inhibitor group and NC-inhibitor group.Cell proliferation ability was detected by MTT proliferation assay.Cell migration ability was detected by cell scratch assay.The relationship between miR-15a and ASM was identified by 3′UTR luciferase reporter assay.miR-15a，ASM，VEGF，IL-1β，IL-6，TNF-α mRNA expression was detected by RT-PCR method.Results In NC-mimic cells and NC-inhibitor cells，the expression of miR-15a in HG group was significantly lower than that in LG group(allP<0.05).The expression level of ASM mRNA in miR-15a mimic group was significantly lower than that in NC-mimic group (P<0.05)，the expression level of ASM mRNA in miR-15a inhibitor group was significantly higher than that in NC-inhibitor group (P<0.05).The cell scratch width in miR-15a mimic group was significantly higher than that in NC-mimic group(P<0.05).The cell scratch width in miR-15a inhibitor group was significantly lower than that in NC-inhibitor group(P<0.05).The absorbance value in miR-15a mimic group was significantly higher than that in NC-mimic group(P<0.05)，the absorbance value in miR-15a inhibitor group was significantly lower than that in NC-inhibitor group(P<0.05).In NC-mimic cells and NC-inhibitor cells，the mRNA expression levels of VEGF，IL-1β，IL-6 and TNF-α in HG group was significantly higher than those in LG group(allP<0.05).Conclusion miR-15a downexpression induces inflammatory reaction and angiogenesis in retinal cells.miR-15a is involved in the pathogenesis of DR by dual regulation of inflammation and angiogenesis.

microRNA； diabetic retinopathy； inflammatory； angiogenesis

*四川省科學(xué)技術(shù)廳科研基金資助項(xiàng)目(No.15ZC0869)

R774.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.014

石 佳，女，1982年生，主治醫(yī)師，碩士研究生，E-mail：1760246657@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：oculistlvhongbin@163.com