梁志紅，劉科成，全智華，唐惠芳

（南華大學附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421000）

房顫患者Cx40基因單核苷酸多態(tài)性研究*

梁志紅，劉科成，全智華，唐惠芳

（南華大學附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421000）

目的 探討縫隙連接蛋白40基因（GJA5）單核苷酸多態(tài)性在房顫發(fā)生中的作用。方法 選擇2012年6～12月南華大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科住院患者200例，分為房顫組98例（持續(xù)性發(fā)顫）及對照組102例（竇性心律）。收集患者一般臨床資料并通過經(jīng)胸心臟彩超采集患者左房內(nèi)徑值，靜脈采血提取DNA，經(jīng)聚合酶鏈反應（PCR）及電泳法檢測SNP的位點，PCR擴增產(chǎn)物純化后直接測序查看SNP位點；哈德溫伯格平衡檢驗后，比較各組間基因分型和基因頻率，就房顫危險因素非條件Logistic回歸分析。結(jié)果 GJA5基因rs10465885存在A/G多態(tài)性，房顫組等位基因A、G頻率分別為0.54和0.46。對照組等位基因A、G頻率分別為0.45和0.55。哈德溫伯格平衡檢驗顯示組間均符合其平衡，房顫組AA基因型高于對照組，AG、GG基因型以及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義。GJA5基因（rs10465885）AA基因型（O∧R=2.49)和左房直徑（O∧R=1.29）是房顫的危險因素，GJA5基因（rs10465885）基因型和左房直徑無關(guān)。結(jié)論 GJA5基因rs10465885位點存在基因多態(tài)性，AA基因型與左房直徑是房顫的危險因素。

GJA5基因；rs10465885；基因型；等位基因；心房顫動

心房的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)在房顫的發(fā)生和維持中起著重要的作用[1]，房顫時結(jié)構(gòu)重構(gòu)分子水平的改變之一為縫隙連接蛋白排列混亂[2]。心臟縫隙連接由40個左右的縫隙連接通道構(gòu)成，心肌細胞主要表達縫隙連接蛋白40（Connexin40，Cx40）和Cx43（Connexin43，Cx43）等。房顫時Cx40表達量減少，分布出現(xiàn)側(cè)邊化改變，影響細胞間的連接和傳導，從而增加房顫的易感性[3-9]。GJA5基因是Cx40蛋白的編碼基因。GROENEWEGEN等[10]在患有心房靜止家族的研究中發(fā)現(xiàn)：Cx40基因啟動子A的-44區(qū)域由G轉(zhuǎn)變?yōu)锳（-44G→A），轉(zhuǎn)錄起始位點71區(qū)域由A轉(zhuǎn)變?yōu)镚（+71A→G）。FIROUZI等[11]對Cx40基因啟動子研究證明其存在單核苷酸多態(tài)性（-44AA/+71GG）。這類患者通過延長心房不應期，更加容易誘導房顫發(fā)生。該2項研究人群均為歐洲白種人群，由于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）存在地域和人種的差異，本研究對衡陽地區(qū)房顫患者GJA5基因位點分布情況進行研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象

病例來自2012年6～12月南華大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科住院患者200例，分為房顫組和對照組。房顫組為持續(xù)性房顫患者（98例），對照組為竇性心律患者（102例）。

排除標準：①肝腎功能衰竭；②心功能IV級；③合并嚴重瓣膜狹窄、心包炎、心肌病、肺心病、先天性心臟病、甲狀腺功能亢進、肥厚性梗阻性心肌病、限制性心肌病、縮窄性心肌病、起搏器術(shù)后或30 d內(nèi)心臟手術(shù)后；④不在衡陽地點居住，不符合調(diào)查對象的條件；⑤不能完成全部的調(diào)查步驟，調(diào)查內(nèi)容有缺失或者調(diào)查數(shù)據(jù)有明顯的錯誤，且數(shù)據(jù)無法進行更正或者核對者。

入組對象為隨機選擇的衡陽地區(qū)漢族人群，年齡≥18歲。資料收集及血樣采集經(jīng)研究對象的知情同意。患者入組后，收集患者一般資料：性別、年齡、有無長期吸煙史、嗜酒史、高血壓病史及相關(guān)實驗室檢查等，并通過經(jīng)胸心臟彩超采集患者左房內(nèi)徑值。

1.2 主要儀器與試劑

ABI3730XL測序分析儀（Applied biosystems公司，美國），PCR儀（Bio-Rad公司，美國），凝膠成像分析儀（Applied Biosystems公司），DNA瓊脂糖凝膠電泳儀（Bio-Rad公司），低溫低速桌面離心機（Beckman公司，美國），低溫高速桌面離心機（Beckman公司），0.1～2.5μl移液器（Eppendorf公司），0.5～10μl移液器（Eppendor公司），2～20μl移液器（Eppendorf公司，德國），50～200μl移液器（Eppendorf公司，德國），100～1 000μl移液器（Eppendorf公司），CPA 225D電子天平（Sartorius公司，德國），超凈工作臺（Heal Force公司，中國），恒溫水浴箱（上海金宏公司，中國），超純水儀（ELGA公司，英國），圓周震蕩器（IKA公司，德國），DW-FL253冰箱（中科美菱公司，中國），-20℃冰柜（海爾公司），WP700P21型微波爐（格蘭仕電器有限公司，中國），OMEGA血樣DNA提取試劑盒（D3471-02）BDv3.0檢測試劑盒。

1.3 標本采集

采集患者住院次日清晨空腹時靜脈血3～5 ml置于K3EDTA采血管和普通生化管內(nèi)，立即置于離心機將血清、血漿和血細胞分離，放入-80℃冰箱中保存以備檢測和DNA提取。

1.4 DNA提取

使用華大基因（武漢分公司）提供的OMEGA血樣DNA提取試劑盒（D3471-02），按照說明書提取血液基因組DNA。

1.5 引物設(shè)計

通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫和Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得GJA5基因的全基因組序列，找出目標SNP片段位置，用Primer5.0軟件（加拿大Primer公司）進行設(shè)計擴增引物對。rs10465885引物：GJA5正向引物：CCAT ACCTCACCTACCAG，GJA5反向引物：CAGTGCTTG CTGCCTTGT。

1.6 PCR擴增

由華大公司負責合成引物。收到引物以先用高速離心機以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心約2 min，然后再開蓋，加入適量的雙蒸水溶解為100 pmol/μl儲存液，再從儲存液中取出用雙蒸水稀釋的20 pmol/μl工作液，最后將工作液分裝進入多個小管后，同儲存液一起放入-20℃冰箱中保存以備用。先用5個樣品進行實驗，獲得滿意擴增效果的條件才確定為最終使用條件。PCR反應總體系為25μl，其中10× CoralLoad PCR Buffer（QIAGEN）2.5μl，25 mmol MgCl20.5μl，dNTP 2μl，正向引物、反向引物各1μl，DNA模板2μl，Taq DNA Polymerase 0.5μl，去離子水15.5μl。按順序依次加入dNTP、P1、P2、Taq酶和雙蒸水，加蓋后先放置在振蕩器上，振蕩30 s，然后再離心30 s。在Mixture中分別加入DNA、10× CoralLoad PCR Buffer（QIAGEN），加樣后進行封蓋，再離心30 s，開啟PCR儀，輸入確定的反應條件參數(shù)，將樣本放入后，自動進行PCR擴增。

1.7 基因分型

PCR反應及電泳法被用來檢測SNP的位點。PCR擴增產(chǎn)物純化后進行直接測序。SNP（rs 10465885）位點由美國生產(chǎn)的ABI3730XL測序儀檢測，應用BDv3.0檢測試劑盒檢測，最后使用Lasergene軟件來尋找SNP位點。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)目的條帶后，Axygen凝膠回收試劑盒純化，應用第一代測序儀，雙脫氧鏈末端終止法（sanger法）進行測序。測序結(jié)果使用Lasergene軟件分析

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。哈德溫伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium）檢驗樣本的群體代表性。計數(shù)資料、基因型、等位基因頻率分布的比較用χ2檢驗；計量資料之間的比較用t檢驗和方差分析。房顫危險因素分析使用多因素非條件Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 房顫組和對照組臨床資料的比較

房顫組與對照組的年齡和左房直徑符合正態(tài)分布；房顫組與對照組之間性別、年齡、吸煙、飲酒史差異均無統(tǒng)計學意義，但左房內(nèi)徑（left atrial diameter，LAD）在房顫組高于對照組。見表1。

2.2 PCR結(jié)果分析

隨機抽取16個PCR樣本進行電泳檢測。PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯示一條特異性熒光帶，即為目的DNA片段。根據(jù)所設(shè)計正反向引物之間的堿基對數(shù)，該片段長度為250～300 bp，電泳后所示的特異性熒光帶符合該長度，故該產(chǎn)物是目的基因（GJA5基因）片段擴增產(chǎn)物。見圖1。

2.3 SNP位點的核苷酸序列分析

ABI3730XL測序儀直接測序后使用lasergene軟件發(fā)現(xiàn)GJA5 rs10465885存在A/G多態(tài)性。見圖2～4。

2.4 哈德溫伯格平衡檢驗

GJA5基因rs10465885位點AA、AG和GG在房顫組實際分布與預期分布差異無統(tǒng)計學意義；在對照組實際分布與預期分布差異無統(tǒng)計學意義，表明兩組研究樣本具有群體代表性。見表2。

2.5 GJA5基因rs10465885多態(tài)性基因分型分析結(jié)果

GJA5基因rs10465885位點位于啟動子B區(qū)的TATA盒區(qū)域。AA基因型分布頻率在房顫組高于對照組（P=0.02），GG基因型和AG基因型在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.6 GJA5基因rs10465885多態(tài)性基因頻率比較

GJA5基因rs10465885位點A、G基因頻率在房顫組以等位基因A為主，對照組以等位基因G為主，雖然房顫組A基因頻率高于對照組，但是差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.227，P=0.072）。見表4。

表1 房顫組和對照組臨床資料比較

圖1GJA5 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 基因型AA（標本A1）

圖3 基因型AG（標本A2）

圖4 基因型GG（標本A11）

表2 各組間哈德溫伯格平衡檢驗

表3 房顫組與對照組基因分型比較 例（%）

2.7 房顫危險因素的非條件多因素Logistic回歸分析

該研究納入分析的房顫患者危險因素有性別、年齡、吸煙史、飲酒史、LAD及3種基因型。以房顫作為因變量，性別、年齡、吸煙史、飲酒史、LAD及3種基因型作為自變量，分別進行賦值。使用非條件多因素Logistic回歸分析，模型的自變量選擇Forward：LR法納入預測變量，自變量的納入模型的概率水平取0.05，剔除的概率水平為0.1，檢驗水準取0.05，最終進入回歸方程的變量有LAD與基因型AA。見表5。

2.8 GJA5基因rs10465885基因分型與左房直徑的關(guān)系

對不同基因型患者的左房直徑比較使用方差分析，其中AA型49例，AG型99例，GG型52例。3種基因型患者的LAD差異沒有統(tǒng)計學意義。見表6。

表4 GJA5基因rs10465885多態(tài)性基因頻率 例（%）

表5 房顫非條件Logistic回歸分析

表6 基因型與左房直徑關(guān)系 （±s）

表6 基因型與左房直徑關(guān)系 （±s）

基因分型LAD/mm F值P值A(chǔ)A（n=49） 37.47±6.56 AG（n=99） 36.23±6.54 0.971 0.379 GG（n=52） 37.58±6.58

3 討論

Cx40是心房的主要縫隙連接蛋白，和Cx43相比較，它在心房特異性表達，而心室表達量極少[12]。SNP是指在基因組水平上，由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，這種突變包括錯意突變和同義突變[13]。GJA5基因編碼 Cx40蛋白是連接蛋白基因家族中重要的一員，因編碼蛋白的分子質(zhì)量為40 kD而得名，定位1q21.1[12]。GJA5基因有2個外顯子，外顯子1A（100 bp）或1B（132 bp）和外顯子2。外顯子1A與1B的差異在于5’端非編碼區(qū)，分別受啟動子A和啟動子B控制，影響蛋白表達的組織特異性。在心臟中2種連接蛋白40都有表達，并特異地表達于人類心房肌、房室結(jié)、His束、左右束支和近端蒲肯野纖維，心室中表達量極少，所有表達的Cx40蛋白均由358個氨基酸組成[12]。

SUN等[14]發(fā)現(xiàn)Cx40蛋白基因突變V85I、L221I與房顫相關(guān)。與野生型GJA5相比，這2種突變均可以通過調(diào)控Cx40蛋白表達來顯著增加縫隙連接半通道電流從而增加房顫發(fā)生，表明GJA5基因變化與房顫的發(fā)病機制具有相關(guān)性。WIRKA等[15]發(fā)現(xiàn)GJA5基因啟動子B區(qū)域TATA盒上存在多態(tài)位點rs10465885，該位點突變引起Cx40表達下降，并與房顫相關(guān)。WIRKA對rs10465885位點的基因分型資料進行薈萃分析，同樣得出rs10465885位點與房顫的發(fā)生相關(guān)。CHRISTOPHERSEN等[16]發(fā)現(xiàn)rs10465885與房顫相關(guān)，該位點與房顫相關(guān)的機制可能是由于該位點通過改變啟動子B的TATA盒序列，影響該啟動子的活動性，從而使Cx40表達下降，從而誘發(fā)房顫的發(fā)生。上述研究均表示rs10465885位點的改變通過調(diào)整Cx40的表達從而影響房顫的發(fā)生。

本研究納入衡陽地區(qū)漢族人群作為研究對象，連續(xù)在南華大學附屬第一醫(yī)院隨機選取98名持續(xù)性房顫患者和102例條件匹配的竇性心律患者，選定 GJA5基因啟動子 B區(qū)的 TAT A盒子區(qū)域rs10465885位點，與房顫進行關(guān)聯(lián)分析。采用準確性最高的直接測序法，發(fā)現(xiàn)房顫組AA基因型高于對照組；該結(jié)果與加拿大學者CHRISTOPHERSEN等[16]一致，房顫組等位基因A位點頻率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與本實驗樣本偏少及人種不同有關(guān)。采用多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果提示：基因型AA攜帶者患房顫風險是非此基因型的2.49倍；在校正年齡、性別、吸煙飲酒史、高血壓病史等因素的影響后，基因型AA仍是衡陽地區(qū)漢族人群房顫的危險因素。該結(jié)果提示GJA5基因rs10465885AA型可能為衡陽地區(qū)漢族人群房顫的易患基因型。

本研究通過3730XL測序儀直接測序后還發(fā)現(xiàn)：入選的房顫患者在rs10465885位點存在A/G多態(tài)性，分別為AA型、AG型和GG型。LAD增大是房顫發(fā)生的危險因素，為了明確該位點不同基因型和左房直徑之間是否存在關(guān)聯(lián)，對房顫患者不同基因型及其對應的LAD之間做方差分析，其中GG型的LAD略大，但差異沒有統(tǒng)計學意義，提示該位點的多態(tài)性與房顫患者LAD無關(guān)。但也可能是因為LAD的擴大是多因素造成，其改變是多種影響綜合引起，亦可能與本實驗樣本量較小相關(guān)。二者之間是否存在關(guān)聯(lián)以及其中的機制，仍需要進一步的研究和擴大樣本量。

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（張西倩 編輯）

Study onCx40gene single nucleotide polymorphism in patients with atrial fibrillation*

Zhi-hong Liang,Ke-cheng Liu,Zhi-hua Quan,Hui-fang Tang (The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421000,China)

Objective To discuss the correlations ofCx40gene(GJA5)single nucleotide polymorphism(SNP)with atrial fibrillation.Methods Two hundreds of patients were selected in the Department of Cardiovascular Medicine, the First Affiliated Hospital of University of South China from June 2012 to December 2012 and divided into atrial fibrillation group(98 cases with continuous fibrillation)and control group(102 cases with sinus rhythm).Clinic information of the patients was collected.Left atrial diameters of the patients were collected through chest and cardiac color ultrasonography.DNA was extracted from venous blood.The locus of SNP was detected through PCR and electrophoresis,and directly examined after PCR products were purified.Based on Hardy-Weinberg Equilibrium examination,the genotype and gene frequency of each group were compared.And non-conditional logistic regression analysis was carried out on the risk factors of atrial fibrillation.ResultsGJA5gene rs10465885 had A/G polymorphism.The frequency of allele A and G of the atrial fibrillation group was 0.54 and 0.46 respectively,and that of the control group was 0.45 and 0.55 respectively.In accordance with Hardy-Weinberg Equilibrium examination,the groups complied with the equilibrium.The AA genotype of the arial fibrillation group was significantly higher than that of the control group.There was not significant difference in AG,GG genotype or allele frequency between the two groups.The AA genotype of rs10465885 locus ofGJA5gene(O∧R=2.49)and left atrial diameter(O∧R=1.29)were the risk factors of atrial fibrillation.The genotype ofGJA5gene(rs10465885)had no correlation with the left atrial diameter.Conclusions Gene polymorphism exists at rs10465885 locus ofGJA5gene.AA genotype and left atrial diameter are the risk factors of atrial fibrillation.

GJA5gene;rs10465885;genotype;allele;atrial fibrillation

R394.5

A

2016-12-18

國家自然科學基金（No：30900625）

唐惠芳，E-mail：1132226235@qq.com；Tel:18573405159

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.19.006

1005-8982（2017）19-0028-06