王永紅，李攀登，肖蕓，萬秀方，鄭丹，溫緣緣，趙雪，張亞莉，楊國珍

(1 貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽550004；2 德陽市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

XPD基因在氫醌致U937細胞DNA損傷修復中的作用

王永紅1，李攀登2，肖蕓1，萬秀方1，鄭丹1，溫緣緣1，趙雪1，張亞莉1，楊國珍1

(1 貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴陽550004；2 德陽市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

目的 探討XPD基因在氫醌(HQ)致U937細胞DNA損傷修復中的作用。方法 選擇5、10、20、40、80 μmol/L HQ分別對U937細胞染毒12、24、48 h，根據(jù)各濃度下U937細胞活性，選擇10、20、40 μmol/L HQ染毒24、48 h進行后續(xù)實驗。取10、20、40 μmol/L HQ染毒24、48 h U937細胞，分別設為HQ低、中、高濃度組，另取未染毒U937細胞作為空白對照組，采用單細胞凝膠電泳檢測各組細胞尾矩(TM)、Oliv尾矩(OTM)，采用Western blotting法檢測各組XPD蛋白相對表達量。結(jié)果 與空白對照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h TM和OTM均明顯增大(P均<0.05)；與同組染毒24 h比較，HQ低、中、高濃度組染毒48 h TM和OTM均明顯增大(P均<0.05)，染毒48 h HQ低、中、高濃度組TM和OTM依次升高(P均<0.05)。與空白對照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24 h XPD蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，且HQ高濃度組明顯高于HQ低濃度組(P均<0.05)；染毒48 h,HQ高濃度組XPD蛋白相對表達量明顯高于空白對照組及HQ低、中濃度組(P均<0.05)，但空白對照組及HQ低、中濃度組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；HQ各濃度組染毒48 h XPD蛋白相對表達量與染毒24 h比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結(jié)論 XPD基因表達上調(diào)可促進HQ致U937細胞DNA損傷修復。

DNA損傷；氫醌；XPD基因；DNA修復

氫醌(HQ)是一種苯的酚類代謝產(chǎn)物，廣泛應用于各種工業(yè)領域。1999年國際癌癥研究機構(gòu)將HQ歸為第三類致癌物之一。動物研究發(fā)現(xiàn)，長期接觸HQ可造成實驗動物肝腎損害，產(chǎn)生骨髓和血液毒性，并導致腫瘤的發(fā)生[1]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期接觸HQ人群可出現(xiàn)骨髓造血功能障礙，甚至白血病[2]。研究認為，HQ可通過氧化作用誘導DNA雙鏈斷裂[3]，而DNA雙鏈斷裂會啟動核苷酸切除修復(NER)系統(tǒng)，繼而進行切除修復。XPD 是轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH的核心組件，在DNA損傷NER過程中具有重要作用。XPD蛋白主要有兩個功能：一是穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子TFⅡH復合物，在NER過程中具有解旋酶功能[4]；二是參與細胞周期調(diào)控及p53介導的細胞凋亡[5]。盡管XPD的解旋酶活性不是TFⅡH調(diào)控轉(zhuǎn)錄所必需的，但XPD的缺失會引起TFⅡH復合物不穩(wěn)定，繼而影響轉(zhuǎn)錄及NER過程[6]。2016年3～7月，本研究觀察了XPD基因在HQ致U937細胞DNA損傷修復中的作用。現(xiàn)分析結(jié)果并報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 U937細胞株，由武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供。HQ，美國Sigma公司。FBS，美國Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，美國HyClone公司；XPD兔單克隆抗體，美國Abcam公司；Lanin B1鼠單克隆抗體，美國Proteintech公司；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；0.4%臺盼藍染色液、BCA蛋白濃度測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。穩(wěn)流電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Eclipe 80i熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Western blotting垂直電泳儀及其轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.2 HQ濃度篩選 取U937細胞約1×106個，置于含10% FBS完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。當細胞生長至鋪滿瓶底90%左右時，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞懸液密度為0.5×106個/mL，并接種于6孔板，每孔4 mL。稱取HQ 0.011 g溶于1 mL完全培養(yǎng)基制成HQ母液，再將HQ母液稀釋100倍，即為1 mmol/L HQ溶液。每孔加入適量1 mmol/L HQ溶液，使其終濃度分別為0、5、10、20、40、80 μmol/L，每個濃度設3個復孔。分別于HQ染毒12、24、48 h收集細胞，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×106個/mL。取細胞懸液90 μL與0.4%臺盼藍染液10 μL混合，輕輕吹打混勻。取混合液10 μL，用改良牛鮑計數(shù)板計數(shù)細胞總數(shù)和活細胞數(shù)(未被臺盼藍染色液染色的細胞即為活細胞)，計算細胞存活率。實驗重復3次，取平均值。各濃度下不同時間細胞存活率比較見表1。結(jié)果表明，隨著HQ濃度增加及作用時間延長，細胞存活率明顯降低。根據(jù)HQ染毒24 h細胞存活率不低于50%，且HQ 0、5 μmol/L染毒24 h細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義，確定后續(xù)實驗HQ染毒濃度分別為10、20、40 μmol/L。為進一步觀察隨著HQ染毒時間延長，DNA損傷及修復基因表達情況，選擇染毒時間分別為24、48 h。

表1 HQ各濃度下染毒12、24、48 h U937細胞存活率比較

注：與 0 μmol/L HQ染毒同時間比較，*P<0.01；與5 μmol/L HQ染毒同時間比較，#P<0.01；與10 μmol/L HQ染毒同時間比較，△P<0.05；與20 μmol/L HQ染毒同時間比較，▲P<0.05；與40 μmol/L HQ染毒同時間比較，▽P<0.05；與同濃度染毒12 h比較，▼P<0.05；與同濃度染毒24 h比較，★P<0.05。

1.3 細胞染毒及DNA損傷檢測 分別收集HQ 10、20、40 μmol/L染毒24、48 h 的U937細胞(分別設為HQ低、中、高濃度組)，同期另選未染毒的U937細胞作為空白對照組。各組均加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞懸液密度為1×106個/mL。將提前預熱的1%普通瓊脂凝膠100 μL滴至磨砂載玻片上，凝結(jié)后為第一層膠。另取各組染毒24、48 h細胞懸液30 μL置于1.5 mL離心管中，加入1.5%低熔點瓊脂270 μL，反復吹打混勻；取混合液100 μL滴加至第一層膠上，即為第二層膠。將做好第二層膠的載玻片放入專用鋁盒中，加入細胞裂解液浸沒，置于4 ℃冰箱內(nèi)避光裂解1 h，PBS沖洗，置于水平電泳槽陽極端附近，加入新鮮配制的堿性電泳液(pH=10)至完全浸沒載玻片，避光解旋20 min，25 V、300 mA電泳20 min。取出載玻片，用Tris-HCl中和液(pH=7.5)漂洗5 min×3次；取2 μg/mL EB 50 μL滴至第二層膠上，置于濕盒中，避光染色15 min，自來水沖洗3次，正置熒光顯微鏡下觀察。隨機取10個200倍視野，采用單細胞凝膠電泳CometScore分析軟件分析50個細胞。以尾矩(TM)和Oliv尾矩(OTM)反映細胞DNA損傷程度。

1.4 XPD蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h細胞及空白對照組細胞各2×106個，根據(jù)細胞核蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒說明提取細胞核蛋白。細胞核蛋白經(jīng)BCA法蛋白定量后，與4×蛋白上樣緩沖液以3∶1混勻，100 ℃水浴5 min，然后行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠+10%分離膠)。取各組核蛋白25 μg上樣，80 V恒壓電泳至Marker分離(約30 min)，換用120 V恒壓電泳，當?shù)鞍咨蠘泳彌_液到達分離膠底部時(約2 h)停止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(220 mA，120 min)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入XPD兔單克隆抗體(1∶5 000)4 ℃過夜，TBST洗膜10 min×3次，羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光，顯影液顯影，定影液定影。凝膠電泳掃描儀灰度掃描后，Image J圖像分析軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以Lamin B1為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組HQ染毒不同時間DNA損傷程度比較 見表2。

2.2 各組HQ染毒不同時間XPD蛋白表達比較 見表3。

表2 各組HQ染毒不同時間DNA損傷程度比較±s)

注：與空白對照組同染毒時間比較，*P<0.05；與HQ低濃度組同染毒時間比較，#P<0.05；與HQ中濃度組同染毒時間比較，△P<0.05；與同組染毒24 h比較，▲P<0.05。

表3 各組HQ染毒不同時間XPD蛋白相對表達量比較±s)

注：與空白對照組染毒同時間比較，*P<0.05；與HQ低濃度組染毒同時間比較，#P<0.05；與HQ中濃度組染毒同時間比較，△P<0.05。

3 討論

苯是一種工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛的有機溶劑，也是常見的環(huán)境污染物之一。因室內(nèi)裝修、汽車尾氣排放、殺蟲劑使用等原因，使眾多非職業(yè)人群長期暴露于低苯環(huán)境中，而長期低苯接觸可造成骨髓造血功能障礙[7]。苯對人類健康的威脅已成為公共健康領域關注的焦點。HQ與苯毒性密切相關，可通過氧化作用直接攻擊DNA分子或與DNA結(jié)合形成加合物，導致DNA鏈斷裂，繼而造成DNA損傷，最終引起染色體畸變[8]。

單細胞凝膠電泳技術(shù)是目前檢測單細胞DNA損傷的常用方法，其TM和OTM可反映DNA損傷程度[9，10]，TM、OTM越大，DNA損傷越嚴重。本研究結(jié)果顯示，HQ低、中、高濃度組染毒24、48 h TM和OTM均高于空白對照組；與同組染毒24 h比較，HQ低、中、高濃度組染毒48 h TM和OTM均明顯增大，且染毒48 h HQ低、中、高濃度組TM和OTM依次升高。表明HQ染毒可導致U937細胞DNA損傷，具有劑量-時間依賴性，與蘇晶等[11]研究結(jié)論基本一致。

研究證實，DNA損傷時，細胞會通過NER、堿基切除修復、錯配修復及同源重組等修復機制，修復受損DNA。NER被認為參與修復大多數(shù)DNA損傷[12]。在NER過程中，XPD基因能利用水解三磷酸核苷產(chǎn)生的能量解開受損DNA雙鏈，這是NER過程的三個限速步驟之一；同時，XPD蛋白還可與XPF形成異二聚體，對損傷的DNA鏈進行5′-3′端切除修復[13]。XPD基因參與DNA修復、重組等多個細胞代謝過程，其在DNA修復中的作用對維持基因組穩(wěn)定尤為重要。陳麗等[14]采用cDNA微陣列技術(shù)，從慢性苯中毒患者和無苯接觸的健康人群中篩選出包括切除修復交叉互補基因1等在內(nèi)的25條差異表達基因。Xiao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，XPD基因(切除修復交叉互補基因2)與慢性苯中毒有關。Chen等[16]研究認為，XPD是與苯中毒相關的DNA修復基因之一。還有研究發(fā)現(xiàn)，XPD基因缺陷會導致著色性干皮病，表現(xiàn)為基因組不穩(wěn)定性增加并有易患腫瘤傾向[17]。HQ作為苯的重要代謝產(chǎn)物，研究XPD基因在HQ致細胞DNA損傷修復中的作用具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，HQ低、中、高濃度組染毒24 h XPD蛋白相對表達量均明顯升高，且HQ高濃度組明顯高于HQ低濃度組；染毒48 h，HQ高濃度組XPD蛋白相對表達量明顯高于空白對照組及HQ低、中濃度組。說明HQ染毒后可能啟動了NER，通過上調(diào)XPD表達，修復受損的DNA。XPD缺失會增加基因組的不穩(wěn)定性，其高表達可能參與修復受損的DNA，雖然XPD表達上調(diào)與DNA損傷同時存在，但XPD表達上調(diào)并未隨染毒時間延長進一步增加，而DNA損傷卻進一步加重。因此推測，HQ染毒后引起的DNA損傷可能沒有完全修復。DNA損傷修復途徑有多種，且基因修復需要眾多蛋白參與，一個修復基因并不能完全反映細胞DNA的整體修復情況，而且DNA損傷的修復過程時間較長，而本研究觀察時間較短，也可能是DNA損傷未完全修復的原因之一。

綜上所述，XPD基因表達上調(diào)可促進HQ致U937細胞DNA損傷修復。但DNA損傷修復機制復雜，HQ所致DNA損傷的詳盡修復機制仍需進一步深入研究。

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Role of XPD gene in DNA damage repair of U937 cells induced by hydroquinone

WANGYonghong1,LIPandeng,XIAOYun,WANXiufang,ZHENGDan,WENYuanyuan,ZHAOXue,ZHANGYali,YANGGuozhen

(1SchoolofChinicalLaboratoryScience,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the role of XPD gene in DNA damage repair of U937 cells induced by hydroquinone (HQ). Methods U937 cells were treated with 5, 10, 20, 40, and 80 μmol/L HQ for 12, 24 and 48 h. According to the cell activity, we selected 10, 20, and 40 μmol/L HQ for the following experiments. U937 cells were treated with 10, 20 and 40 μmol/L HQ for 24 and 48 h, which were taken as the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups, meanwhile, the untreated U937 cells were taken as the blank control group. Single cell gel electrophoresis tail moment (TM) and Oliv tail moment (OTM) were used to detect DNA damage. The relative expression of XPD protein in each group was determined by Western blotting. Results Compared with the blank control group, TM and OTM in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 24, 48 h significantly increased (bothP<0.05). TM and OTM in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 48 h significantly increased as compared with that of the same group at 24 h (bothP<0.05), and the TM and OTM values of the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups increased successively (bothP<0.05). Compared with the blank control group, the relative expression of XPD protein in the low-dose, medium-dose, and high-dose HQ groups at 24 h was significantly higher (P<0.05), and the high-dose group was significantly higher than the low-dose group (P<0.05). The relative expression of XPD protein in the high-dose HQ group at 48 h was significantly higher than that in the blank control group, low-dose, and medium-dose HQ groups (P<0.05), but there was no significant difference between the blank control group and low-dose and medium-dose HQ groups (allP>0.05). The relative expression of XPD protein in each group at 48 h was not significantly different from that at 24 h (allP>0.05). Conclusion The up-regulation of XPD gene expression promotes the repair of DNA damage of U937 cells induced by HQ.

DNA damage; hydroquinone; XPD gene; DNA repair

國家自然科學基金資助項目(81360437)；貴州省科教青年英才培養(yǎng)工程項目(黔省專合字〔2012〕164號)。

王永紅(1989-)，女，碩士研究生，主要研究方向為造血損傷的分子機制。E-mail: 1239976713@qq.com

張亞莉(1973-)，女，教授，主要研究方向為造血損傷的分子機制。E-mail： zhangyl20011002@aliyun.com 楊國珍(1954-)，女，教授，主要研究方向為出生缺陷篩查及其發(fā)病機制。E-mail： yangguozhen-kong@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.002

Q754

A

1002- 266X(2017)28- 0005- 04

2016-12- 07)