馬方旭，張秀瓏，張志華，王布，湯建華

(1 河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

川芎嗪聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制

馬方旭1，張秀瓏2，張志華2，王布2，湯建華2

(1 河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2 河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

目的 探討川芎嗪(TMP)聯(lián)合順鉑(DDP)對(duì)肺腺癌小鼠的抑瘤效果及其作用機(jī)制。方法 將56只C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為生理鹽水組、DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組。各組右腋皮下接種Lewis肺腺癌細(xì)胞，建立移植瘤模型。接種第7天，生理鹽水組腹腔注射生理鹽水0.2 mL，TMP組腹腔注射TMP 100 mg/kg，DDP組腹腔注射DDP 2 mg/kg，TMP聯(lián)合DDP組腹腔注射TMP及DDP，劑量同上，每天1次，連續(xù)2周。末次注射24 h，各組均眼球取血，檢測(cè)血清CXCL16、TNF-α；斷頸處死，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率；取部分腫瘤組織，檢測(cè)CXCL16、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率分別為40.74%、21.69%、61.11%，TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組(P均<0.05)，而DDP組與TMP組比較P>0.05。DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組血清CXCL16水平及腫瘤組織CXCL16蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于生理鹽水組，以TMP聯(lián)合DDP組最低(P均<0.05)；血清TNF-α水平及腫瘤組織TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于生理鹽水組，以TMP聯(lián)合DDP組最高(P均<0.05)；DDP組與TMP組血清CXCL16、TNF-α水平及腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較P均>0.05。結(jié)論 TMP、DDP對(duì)肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用，二者聯(lián)合抑瘤效果更佳；其作用機(jī)制可能與上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)CXCL16表達(dá)有關(guān)。

肺腺癌；川芎嗪；順鉑；趨化因子配體16；腫瘤壞死因子α

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中約50%為肺腺癌。手術(shù)、放化療及靶向治療是目前治療肺腺癌的主要方法，但總體治療效果較差。川芎嗪(TMP)是臨床常用活血化瘀藥川芎的主要活性成分，屬于酰胺類生物堿。TMP作為血管新生抑制劑，不但可直接抑制腫瘤生長(zhǎng)，還可提高化療藥物免疫調(diào)節(jié)作用，間接發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。順鉑(DDP)是臨床常用的抗腫瘤藥，具有抗腫瘤譜廣、作用強(qiáng)，可與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用且無交叉耐藥等特點(diǎn)。故理論上TMP輔助治療能提高DDP的化療效果[2]，但目前關(guān)于二者聯(lián)合用于肺腺癌治療的報(bào)道較少。CXCL16是近年新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，具有促血管新生作用[3]。TNF-α是目前公認(rèn)抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TMP聯(lián)合DDP是否通過CXCL16、TNF-α發(fā)揮作用尚不清楚。2016年2～8月，我們觀察了TMP聯(lián)合DDP對(duì)肺腺癌小鼠的抑瘤效果，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性C57BL/6小鼠56只，5～6周齡，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自中國(guó)軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK2011- 0004。Lewis肺腺癌瘤株，由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。HS-1300-U型超凈工作臺(tái)，上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司。鹽酸川芎嗪注射液，廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司；注射用順鉑，齊魯制藥有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司；兔抗鼠CXCL16抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠TNF-α抗體，武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；EDTA，美國(guó)Gibco公司；小鼠CXCL16 ELISA試劑盒，上海研晶生化試劑有限公司；小鼠TNF-α ELISA試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 模型制備及分組處理 取Lewis肺腺癌細(xì)胞，接種于含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用含EDTA的胰酶消化后傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺腺癌細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，用生理鹽水制備密度為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液0.2 mL，接種于小鼠右腋皮下，制備Lewis肺腺癌模型。接種第2天，隨機(jī)將小鼠分為生理鹽水組、TMP組、DDP組、TMP聯(lián)合DDP組，每組14只。接種第7天，所有小鼠可觸及直徑2～3 mm的腫瘤，表明模型制備成功。模型制備成功同日，生理鹽水組腹腔注射生理鹽水0.2 mL，TMP組腹腔注射TMP 100 mg/kg，DDP組腹腔注射DDP 2 mg/kg；TMP聯(lián)合DDP組腹腔注射TMP 100 mg/kg+DDP 2 mg/kg。每天1次，連續(xù)2周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 血清CXCL16、TNF-α水平 末次注射24 h，眼球取血，靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)血清CXCL16、TNF-α。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.2 抑瘤率 各組眼球取血后，斷頸處死，分離腋下腫瘤組織，清理干凈后稱質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(對(duì)照組腫瘤質(zhì)量-觀察組腫瘤質(zhì)量)/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.3.3 腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白表達(dá) 采用免疫組化SP法。取各組腫瘤組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片經(jīng)脫蠟水化，97 ℃枸櫞酸鹽修復(fù)液修復(fù)，室溫冷卻10 min，5% BSA常溫封閉15 min，分別滴加兔抗小鼠CXCL16一抗(1∶50)或TNF-α一抗(1∶100)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，濕盒30 min，4 ℃冰箱過夜。次日37 ℃復(fù)溫45 min，甩去多余液體，PBS沖洗。用濾紙將組織周圍的液體吸干，加入羊抗兔二抗(1∶200)，37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS沖洗。DAB避光染色2 min，蘇木素復(fù)染，氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水，透明，封片，顯微鏡下拍照觀察。CXCL16或TNF-α蛋白陽(yáng)性表達(dá)定位于胞質(zhì)或胞膜，呈棕黃色顆粒狀。采用Image-proplus6.0軟件分析圖像，統(tǒng)計(jì)積分光密度(IOD)值[4]。以IOD值代表目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CXCL16、TNF-α水平比較 見表1。

2.2 各組抑瘤率比較 生理鹽水組、DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組腫瘤質(zhì)量分別為(3.78±0.09)、(2.24±0.26)、(2.96±0.25)、(1.47±0.30)g，抑瘤率分別為0、40.74%、21.69%、61.11%。TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組(P均<0.05)，而DDP組與TMP組比較P>0.05。

表1 各組血清CXCL16、TNF-α水平比較

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與DDP組比較，#P<0.05；與TMP組比較，△P<0.05。

2.3 各組腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與DDP組比較，#P<0.05；與TMP組比較，△P<0.05。

3 討論

肺腺癌細(xì)胞主要來源于支氣管黏膜上皮，一般情況下腫瘤生長(zhǎng)較緩慢，但早期即可發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。因早期無明顯臨床癥狀，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期。肺腺癌的治療方法較多，但含鉑類的化療方案仍占有重要地位。近年來隨著對(duì)中醫(yī)藥理研究的深入，發(fā)現(xiàn)中藥輔助西藥化療不但能增加化療藥物敏感性，增強(qiáng)化療效果，還能降低化療藥物引起的毒副作用，提高患者機(jī)體免疫力，延長(zhǎng)患者生存期[5，6]。因此，探索高效低毒的增敏劑以增強(qiáng)化療藥物療效，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

TMP是中藥川芎、當(dāng)歸的主要活性成分，其有效化學(xué)成分為四甲基吡嗪，具有抗炎、抗凋亡、舒張血管等多種生物學(xué)活性，在心腦血管病、消化系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)疾病中應(yīng)用較為廣泛[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，TMP不僅能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還能間接抑制腫瘤血管生成，繼而抑制腫瘤生長(zhǎng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，TMP能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞G1期阻滯和早期凋亡[9]； TMP能夠引起U937細(xì)胞中凋亡抑制因子、凋亡促進(jìn)因子及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的變化，啟動(dòng)凋亡程序，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]；TMP還可抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯、抑制NF-κB及其靶基因蛋白表達(dá)等[11]；TMP能通過上調(diào)NK細(xì)胞等的生物學(xué)活性，調(diào)控Th2類細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)，提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答效果，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用，間接發(fā)揮抗腫瘤作用[12]；TMP還可增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，降低化療藥物引起的毒副作用，改善腫瘤組織周圍的微環(huán)境及腫瘤細(xì)胞的缺氧環(huán)境，增強(qiáng)腫瘤在放療中的敏感性[13,14]。DDP是臨床應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥，可與DNA結(jié)合形成DDP-DNA復(fù)合物，導(dǎo)致DNA復(fù)制障礙，從而抑制腫瘤細(xì)胞分裂，為非特異性細(xì)胞周期化療藥物。有研究表明，TMP聯(lián)合DDP不僅能增強(qiáng)DDP的化療效果，還能降低化療藥物引起的毒副作用[15，16]。本研究結(jié)果顯示，TMP聯(lián)合DDP組抑瘤率明顯高于DDP組、TMP組，而DDP組與TMP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明TMP和DDP均具有抑瘤作用，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

CXCL16是近年發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，屬于CXC趨化因子家族。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CXCL16的研究主要集中于心血管疾病、免疫性疾病及炎癥性疾病等方面。除在先天性免疫和獲得性免疫介導(dǎo)的機(jī)體防御中具有重要作用外，CXCL16還能介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和血管生成[17]。CXCL16與其惟一的受體CXCR6結(jié)合，可激活NF-κB和AKT/mTOR等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽類細(xì)胞因子，是迄今為止抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子。TNF-α不僅能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路干擾腫瘤血管系統(tǒng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)機(jī)體免疫力[19，20]，還可誘導(dǎo)腫瘤血管的高滲透性，使腫瘤部位化療藥物濃度升高，提高抗腫瘤效果[21]。本研究結(jié)果顯示，DDP組、TMP組、TMP聯(lián)合DDP組血清CXCL16水平及腫瘤組織CXCL16蛋白表達(dá)均低于生理鹽水組，以TMP聯(lián)合DDP組最低；血清TNF-α水平及腫瘤組織TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于生理鹽水組，以TMP聯(lián)合DDP組最高；DDP組與TMP組血清CXCL16、TNF-α水平及腫瘤組織CXCL16、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明TMP和DDP均能通過抑制CXCL16表達(dá)，促進(jìn)TNF-α表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，繼而抑制腫瘤生長(zhǎng)，二者聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。

綜上所述，TMP、DDP對(duì)肺腺癌小鼠均有一定抑瘤作用，二者聯(lián)合應(yīng)用抑瘤效果更佳；其作用機(jī)制可能與上調(diào)TNF-α表達(dá)、下調(diào)CXCL16表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題資助計(jì)劃項(xiàng)目(20170185)。

張秀瓏(E-mail： zzh19641229@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.011

R734.2

A

1002- 266X(2017)28- 0040- 03

2016- 09-27)