朱超英，溫炬，李婷，趙琪楠，秦思

(1 南方醫(yī)科大學附屬廣東省第二人民醫(yī)院，廣州510317；2南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院)

IL-36α對銀屑病小鼠皮膚病變的影響及其作用機制

朱超英1，2，溫炬1，李婷1，趙琪楠1，秦思1

(1 南方醫(yī)科大學附屬廣東省第二人民醫(yī)院，廣州510317；2南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院)

目的 探討白細胞介素36α(IL-36α)對銀屑病小鼠皮膚病變的影響及其作用機制。方法 將30只雌性小鼠隨機分為對照組、模型組及觀察組，每組10只。模型組及觀察組于背部裸露皮膚處涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，對照組涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，連續(xù)8天。觀察組隔日皮下注射IL-36α 5 μg，對照組、模型組注射等量PBS，共注射4次。評估各組建模第1～8天銀屑病皮損面積和嚴重程度評分(PASI評分)。建模第8天處死，測量表皮垂直厚度，分別采用實時熒光定量PCR法、Western blotting法檢測皮膚組織血管內皮生長因子(VEGF)和IL-36α mRNA和蛋白相對表達量。結果 隨建模時間延長，模型組和觀察組PASI評分逐漸升高(P均<0.05)。觀察組、模型組建模第5天開始PASI評分明顯升高，以觀察組升高更明顯(P均<0.05)。觀察組表皮垂直厚度為(98.519±3.442)μm，模型組為(68.383±2.499)μm，對照組為(9.804±1.682)μm，組間兩兩比較P均<0.05。觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達量依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。結論 IL-36α可加重銀屑病小鼠皮膚病變，其機制可能與促進VEGF表達有關。

銀屑??；白細胞介素36α；血管內皮生長因子

銀屑病屬于慢性炎癥性增生性皮膚病之一，主要組織病理學改變?yōu)樾律苄纬?、角質形成、細胞過度增生及炎癥細胞浸潤等[1]。白細胞介素36(IL-36)是一種新型促炎性因子，屬于IL-1家族，由3個生物學功能相似的分子(IL-36α、IL-36β及IL-36γ)組成。IL-36受體(IL-36R)主要表達于皮膚組織，IL-36與其受體結合后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB，在銀屑病、系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征等疾病的發(fā)生中具有重要作用[2～5]。目前，關于IL-36α在銀屑病發(fā)病中的作用及其機制尚不完全明了。為此，我們于2016年2～8月進行如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雌性BALB/c小鼠30只，SPF級，6～8周齡，體質量18～20 g，購自南方醫(yī)科大學。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～24 ℃，光照12 h明暗交替，自由攝食飲水。5%咪喹莫特乳膏(美國3M公司)，凡士林乳膏(河北蘭煉飛天石化有限公司)，IL-36α(美國R&D公司)，Anti-VEGFA抗體(美國Abcam公司)，ECL顯色液及DAB顯色液(杭州弗德生物科技有限公司)，逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國DBI公司)；多功能酶標儀(上?，F科分光儀器有限公司)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 銀屑病模型建立及干預 將30只小鼠隨機分為對照組、模型組及觀察組，每組10只，單籠飼養(yǎng)。各組背部剃毛，裸露皮膚，面積約2 cm×3 cm。模型組及觀察組于裸露皮膚處涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，對照組涂抹等量凡士林乳膏，1次/d，連續(xù)8天。觀察組隔日皮下注射IL-36α 5 μg，對照組、模型組注射等量PBS，共注射4次。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 銀屑病皮損面積和嚴重程度評分(PASI評分) 觀察各組建模第1～8天皮膚變化并行PASI評分。PASI評分標準包括紅斑、鱗屑及浸潤增厚3個項目，每個項目共4分，無為0分、輕度為1分、中度為2分、重度為3分、極重度為4分，總分12分。PASI評分越高說明銀屑病皮損越嚴重[6]。

1.3.2 皮膚組織病理學變化及表皮厚度 各組于建模第8天采用頸椎脫臼法處死，取背部皮損面積約1 cm×1 cm，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片。常規(guī)HE染色，100倍顯微鏡下觀察皮損增厚程度、炎癥細胞浸潤情況等。同時，測量表皮垂直厚度。

1.3.3 皮膚組織血管內皮生長因子(VEGF)和IL-36α mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。取凍存皮膚組織，TRIzol法提取組織總RNA。根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄。采用實時熒光定量PCR儀進行擴增。引物序列：VEGF上游引物：5′-GTCTGTGCTCTGGGATTTG-3′，下游引物：5′-ATTTCCACAATCCGAAGTGA-3′；IL-36α上游引物：5′-ACCTCTACATTTGAGTCTGC-3′，下游引物：5′-GATGAAGATTTCCCCCAGTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物：5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共45個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算VEGF和IL-36α mRNA相對表達量。

1.3.4 皮膚組織IL-36α蛋白表達 采用Western blotting法。取凍存皮膚組織，RIPA裂解，提取皮膚組織蛋白，BCA法進行蛋白定量。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE，然后將蛋白電泳產物轉印至NC膜，用含3%脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫孵育1 h，ECL顯色。采用Image J圖像分析系統分析電泳條帶的光密度(OD)值。以β-actin為內參，以目的蛋白與內參蛋白OD值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.3.5 皮膚組織VEGF蛋白表達 ①Western blotting法。參照1.3.4的方法檢測VEGF蛋白相對表達量。②免疫組化法。皮膚組織石蠟切片經脫蠟、水化，抗原修復，加入一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)4 ℃孵育50 min。DAB顯色，蘇木精復染，同步設立陰性對照。以細胞質、細胞核內出現淡棕色、淡褐色、棕色、棕褐色以及褐色顆粒為陽性染色。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，根據陽性細胞百分比及染色強度綜合評分。陽性細胞百分比：0～5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強度：無著色為0分，淡褐色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。兩項評分相加≥1分為陽性。

2 結果

2.1 各組皮膚變化及PASI評分比較 對照組背部皮膚正常，無明顯變化。隨著建模時間延長，模型組和觀察組逐漸出現紅斑、增厚、鱗屑；模型組建模第7、8天出現典型銀屑病樣改變，第8天部分出現脫屑；觀察組建模第4～8天開始出現典型銀屑病樣改變，其紅斑、鱗屑、增厚表現均較模型組嚴重。各組建模第1、2天PASI評分均為0分；隨建模時間延長，觀察組及模型組PASI評分逐漸升高(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組、模型組建模第5天開始PASI評分均升高，但觀察組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組建模第3～8天PASI評分比較

注：與對照組同時間比較，*P<0.05；與模型組同時間比較，#P<0.05。

2.2 各組皮膚組織病理學變化及表皮厚度比較 對照組皮膚未見明顯異常。模型組呈銀屑病樣改變，表皮明顯增厚，可見鱗屑、角化不全及Muro微膿腫，棘層增厚明顯，表皮突延長。觀察組各層變化及炎癥細胞浸潤均較模型組明顯。見插頁Ⅰ圖3。觀察組表皮垂直厚度為(98.519±3.442)μm，模型組為(68.383±2.499)μm，對照組為(9.804±1.682)μm，組間兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組皮膚組織VEGF及IL-36α表達比較 觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達量均依次降低，組間兩兩比較P均<0.05。見表2。

表2 各組皮膚組織VEGF、IL-36α mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組皮膚組織VEGF蛋白表達比較 見插頁Ⅰ圖4。免疫組化染色結果顯示，對照組VEGF僅少量表達，在真皮乳頭微血管輕度染色，呈淡褐色；模型組著色細胞層數及數量顯著增多，VEGF顯著染色，主要表達于表皮及血管內皮細胞，呈褐色；觀察組著色細胞數量多于模型組，VEGF染色呈深褐色，主要表達于表皮層及血管內皮細胞。觀察組、模型組和對照組皮膚組織VEGF 陽性表達率分別為100%、100%、10%。觀察組、模型組明顯高于對照組(P均<0.05)。

3 討論

多項研究表明，IL-36與銀屑病的發(fā)生密切相關[7～10]。銀屑病發(fā)病過程中表皮角質形成細胞加強了VEGF的自我表達，并通過一系列信號傳導，促進血管通透性增加及血管內皮細胞增殖、遷移，最終形成新生血管。朱凡等[11]研究表明，由角質形成細胞分泌的VEGF對銀屑病皮損部血管異常起著決定性作用。Towne等[2]研究認為，IL-36可促進角質形成細胞分泌VEGF。既往研究表明，IL-17可促進角質形成細胞分泌VEGF，而IL-36又可促進角質形成細胞分泌IL-17[12]，這間接提示IL-36可促進VEGF分泌。有研究發(fā)現，IL-1家族中的IL-1及IL-33可促進VEGF分泌[13]，而IL-36也屬于IL-1家族，進一步提示IL-36可促進VEGF分泌。

咪喹莫特是一種免疫激活劑，通過激活Toll樣受體刺激小鼠產生銀屑病樣皮損，并已廣泛用于銀屑病動物模型的建立[14]。本研究結果顯示，模型組與觀察組在背部涂抹咪喹莫特后逐漸出現紅斑、鱗屑、增厚現象，伴有角質層、棘細胞層的增厚以及顆粒層消失，而對照組未見明顯異常，表明銀屑病小鼠建模成功。既往研究發(fā)現，皮下注射IL-36α的小鼠背部皮膚可出現明顯的炎癥細胞浸潤[9]，而氣管內灌注IL-36α的小鼠肺部可出現大量的趨化因子、腫瘤壞死因子等炎癥因子浸潤[15]。本研究結果顯示，觀察組較模型組皮膚炎癥反應更為嚴重，且觀察組、模型組和對照組IL-36α mRNA和蛋白相對表達量依次降低，表明IL-36α可加重銀屑病小鼠的皮膚炎癥反應。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組與觀察組VEGF mRNA和蛋白相對表達量均明顯升高，而觀察組升高更明顯，表明IL-36α可促進VEGF表達。另外，免疫組化結果顯示，對照組表皮層幾乎不表達VEGF，僅在真皮乳頭層微血管處低表達，呈淡褐色；而模型組與觀察組著色細胞層數及數量較對照組增多，VEGF表達于表皮層及真皮層，且觀察組著色細胞數量多于模型組，呈深棕褐色；且觀察組與模型組VEGF陽性表達率明顯高于對照組，進一步證實IL-36α可促進VEGF的表達。

綜上所述，IL-36α可加重銀屑病小鼠皮膚病變，其機制可能與促進VEGF的表達有關。

[1] 趙京霞,底婷婷,王燕,等.IL-23/ IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠.銀屑病樣皮膚損害中的作用[J].中國病理生理雜志,2013,29(6):1086-1094.

[2] Towne JE, Sims JE. IL-36 in psoriasis[J].Curr Opin Pharmacol, 2012,12(4):486-490.

[3] Hovdenak N, Haram K. Influence of mineral and vitamin supplements on pregnancy outcome[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2012,164(2):127-132.

[4] Ciccia F, Accardo-Palumbo A, Alessandro R. IL-36 α axis is modulated in patients with primary Sjogren′s Syndrome[J]. Clin Exp Immunol, 2015,181(2):230-238.

[5] Takahashi K, Nishida A, Shioya M, et al. Interleukin (IL)-1β is a strong inducer of IL-36γ expression in human colonic myofibroblasts[J]. PLoS One, 2015,10(11):e138423.

[6] Wolf J, Ferris LK. And-IL-36R antibodies, potentially useful for the treatment of psoriasis: a patent evaluation of W02013074569[J]. Expert Opin Ther Pat, 2014,24(4):477-479.

[7] Blumberg H, Dinh H, Trueblood ES, et al. Opposing activities of two novel members of the IL-1 ligand family regulate skin inflammation[J]. J Exp Med, 2007,204 (11):2603-2614.

[8] Kanazawa N, Nakamura T, Mikita N, et al. Novel IL36RN mutation in a Japanese case of early onset generalized pustular psoriasis[J]. J Dermatol, 2013,40(9):749-751.

[9] Foster AM, Baliwag J, Chen CS, et al. IL-36 promotes myeloid cell infiltration, activation, and inflammatory activity in skin[J]. J Immunol, 2014,192(12):6053-6061.

[10] Tortola L, Rosenwald E, Abel B, et al. Psoriasiform dermatitis is driven by IL-36-mediated DC-keratinocyte crosstalk[J]. J Clin Invest, 2012,122 (11):3965-3976.

[11] 朱凡,鄭敏,鮑彰,等.銀屑病患者皮損中血管內皮生長因子受體的表達與血管增生的關系[J].中華皮膚科雜志,2003,36(7):365-367.

[12] Friedrich M, Tillack C, Wollenberg A, et al. IL-36g sustains a proinflammatory self-amplifying loop with IL-17C in anti-TNF-induced psoriasiform skin lesions of patients with Crohn ′s Disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2014,20(11):1891-1901.

[13] Theoharides TC, Zhang B, Kempuraj D, et al. IL-33 augments substance P-induced VEGF secretion from human mast cells and is increased in psoriatic skin[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(9):4448-4453.

[14] Gilliet M, Conrad C, Geiges M, et al. Psoriasis triggered by toll like receptor 7 agonist imiquimod in the presence of dermal plasmacytoid dendritic cell precursors[J]. Arch Dermatol, 2004,140(12):1490-1495.

[15] Ramadas RA, Ewart SL, Iwakura Y, et al. IL-36a exerts pro-inflammatory effects in the lungs of mice[J]. PLoS One, 2012,7(9):e45784.

廣東省中醫(yī)藥局基金資助項目(20141008)。

溫炬(E-mail： gdwenju@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.28.010

R758.63

A

1002- 266X(2017)28- 0037- 03

2016- 09- 03)