趙志敏，王國(guó)坤，王楊，楊帆，龔德軍，徐志云

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海200433)

膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的大鼠RASMCs生長(zhǎng)、增殖及分化對(duì)比觀察

趙志敏，王國(guó)坤，王楊，楊帆，龔德軍，徐志云

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海200433)

目的 比較膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)生長(zhǎng)、增殖及分化的影響。方法 選擇6～8周齡雄性SD大鼠6只，取胸主動(dòng)脈及主動(dòng)脈弓部，保留中膜備用。分別采用膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)RASMCs。采用α-肌動(dòng)蛋白免疫熒光染色法鑒定RASMCs，并比較兩種方法培養(yǎng)第0、24、36、48、60、72、84、96 h RASMCs生長(zhǎng)情況。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞表型標(biāo)志基因表達(dá)，包括收縮型標(biāo)志基因α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)膠蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重鏈11(MYH-11)、轉(zhuǎn)錄因子1(SP-1)及合成型標(biāo)志基因骨橋蛋白(OPN)。結(jié)果 膠原酶消化法、組織塊貼壁法均成功分離出RASMCs,細(xì)胞純度均在95%以上。培養(yǎng)36、48、60、72 h時(shí)，組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs計(jì)數(shù)多于膠原酶消化法(P均<0.05)。培養(yǎng)36、48、60、72 h時(shí)，膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs活力優(yōu)于組織塊貼壁法(P均<0.05)。兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs G1、G2、S期細(xì)胞所占比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于組織塊貼壁法，OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于組織塊貼壁法(P均<0.05)。結(jié)論 膠原酶消化法、組織塊貼壁法均成功分離、培養(yǎng)出RASMCs。膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs生長(zhǎng)、增殖較慢，但保持收縮表型；組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs生長(zhǎng)、增殖較快，但有向合成表型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

血管平滑肌細(xì)胞；胸主動(dòng)脈；膠原酶消化法；組織塊貼壁法；細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；大鼠

主動(dòng)脈夾層(AD)是一類(lèi)病死率較高的疾病[1,2]。研究顯示，約80%未經(jīng)醫(yī)學(xué)干預(yù)的Stanford A型AD患者在發(fā)病2周內(nèi)會(huì)因主動(dòng)脈夾層破裂死亡[3]。目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是構(gòu)成血管壁中膜的主要結(jié)構(gòu)及物質(zhì)基礎(chǔ)，可保持血管壁完整性、維持血管壁張力[4]，同時(shí)在血管內(nèi)膜增生、血管重塑、血管外膜基質(zhì)的分泌和降解等病理生理過(guò)程中具有重要作用[5]。VSMCs的增殖、凋亡及表型改變與AD的發(fā)生密切相關(guān)，其生物學(xué)特征的改變可能是AD發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制之一[6]。VSMCs主要有收縮表型和合成表型兩種。病理狀態(tài)下，VSMCs會(huì)由正常成年人的收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，并參與動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈瘤等多種心血管疾病的發(fā)展[7，8]。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)膠蛋白(TAGLN)、肌球蛋白重鏈11(MYH-11)、轉(zhuǎn)錄因子1(SP-1)是常用的收縮表型標(biāo)志基因，骨橋蛋白(OPN)是常用的合成表型標(biāo)志基因。組織塊貼壁法和膠原酶消化法是VSMCs經(jīng)典的培養(yǎng)方法[9，10]，但目前關(guān)于不同方法培養(yǎng)的VSMCs生物學(xué)表型是否有差異鮮見(jiàn)報(bào)告。2015年1月～2016年3月，我們對(duì)比觀察膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)生長(zhǎng)、增殖及分化情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 6～8周齡、雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量150～200 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。DMEM培養(yǎng)基、FBS、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Ⅰ 型膠原酶、牛血清白蛋白(BSA)、DAPI均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。兔抗鼠α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗、TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。倒置顯微鏡(IX-70)、熒光正置顯微鏡(BX-60)購(gòu)自日本Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(BB5060UV)購(gòu)自美國(guó)Heraeus公司；超凈工作臺(tái)(ZHJH-C1214B)購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；離心機(jī)(ST 16R)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientfic公司；熒光定量PCR儀(LC480Ⅱ)購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 RASMCs分離 所有大鼠10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌條件下迅速分離胸主動(dòng)脈及主動(dòng)脈弓，并置于0.01 mol/L D-Hanks培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，D-Hanks漂洗數(shù)次，顯微器械仔細(xì)剝離胸主動(dòng)脈及主動(dòng)脈弓，將胸主動(dòng)脈外膜纖維結(jié)締組織剝離干凈，眼科剪縱向剪開(kāi)主動(dòng)脈，內(nèi)膜面朝上，用刀片來(lái)回輕刮2～3次，去除內(nèi)膜，保留中膜備用。

1.3 RASMCs培養(yǎng) 分別采用膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)RASMCs。膠原酶消化法：將處理好的主動(dòng)脈壁中膜用眼科剪剪成1 mm×1 mm大小的組織塊，放入培養(yǎng)皿中，加入0.2 mg/mL Ⅰ型膠原酶2 mL，37 ℃、5 % CO2孵育箱中培養(yǎng)約12 h，待組織塊消化成絮狀物時(shí)用移液器充分吹打均勻，100目無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾。留取濾液，加入15 mL離心管中，200×g離心7 min，棄上清。加入5 mL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)皿，37 ℃、5 % CO2孵育箱中培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)液。RASMCs呈圓形并懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)48 h細(xì)胞貼壁呈梭形生長(zhǎng)(見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1A)。組織塊貼壁法：將處理好的主動(dòng)脈壁中膜用眼科剪剪成1 mm×1 mm大小的的組織塊，邊緣整齊光滑，用彎頭鑷夾取組織塊，蘸取少量FBS后均勻貼放于培養(yǎng)瓶底面，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，待組織塊貼壁后輕輕翻轉(zhuǎn)，加入少量含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。每2天更換1次培養(yǎng)液。RASMCs在貼壁3～4天從組織塊邊緣爬出，6～8天細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形并在組織塊邊緣呈放射狀生長(zhǎng)(見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖1B)。

1.4 RASMCs鑒定及其生長(zhǎng)、增殖、分化觀察

1.4.1 RASMCs鑒定 采用α-actin免疫熒光染色法[10]。分別取膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的傳2代RASMCs，接種于內(nèi)置有細(xì)胞爬片的24孔板中，2×104個(gè)/孔；培養(yǎng)24 h待細(xì)胞自然貼壁，PBS沖洗3 min×3次；加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min，PBS沖洗3 min×3次；加入Triton-X-100，4 ℃孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次；加入5%山羊血清，室溫封閉1 h；加入兔抗鼠α-actin抗體(稀釋倍數(shù)1∶400)200 μL/孔，4 ℃雜交過(guò)夜，PBS沖洗3 min×3次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶400)，室溫雜交1 h，PBS沖洗3 min×3次；加入DAPI，避光復(fù)染細(xì)胞核10 s，PBS沖洗3 min×3次；50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察兩種方法培養(yǎng)的細(xì)胞表面是否表達(dá)α-actin抗體，并計(jì)算細(xì)胞純度。

1.4.2 RASMCs生長(zhǎng)觀察 ①分別取膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的傳2代RASMCs，接種于24孔板中，2×104個(gè)/孔。分別于培養(yǎng)第0、24、36、48、60、72、84、96 h收集細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取其平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。②采用CCK-8法[11]。分別取膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的傳2代RASMCs接種于96孔板中，5×103個(gè)/孔。每孔加入100 μL培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h。分別于培養(yǎng)第0、24、36、48、60、72、84、96 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4.3 RASMCs細(xì)胞周期[12]觀察 分別取膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的70%～80%融合后傳3代RASMCs，消化、洗滌，離心，棄上清，用預(yù)冷的70%乙醇固定24 h，PBS沖洗3 min×3次，加入200 μL PI染色液，避光反應(yīng)30 min，BDFACS Calibur流式細(xì)胞儀觀察、Modfit軟件分析細(xì)胞周期分布情況。

1.4.4 RASMCs表型標(biāo)志基因α-SMA、TAGLN、MYH-11、SP-1、OPN檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。分別取膠原酶消化法、組織塊貼壁法培養(yǎng)的傳2代RASMCs，加入1 mL TRIzol試劑，反復(fù)吹打，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量。以500 ng總RNA為模板，將α-SMA、TAGLN、MYH-11、SP-1、OPN的上下游引物[13,14]，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。適當(dāng)稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

膠原酶消化法、組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs胞質(zhì)均有明顯紅色熒光標(biāo)記，說(shuō)明兩種方法均成功分離、培養(yǎng)出RASMCs,細(xì)胞純度均在95%以上。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖2。

2.1 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs生長(zhǎng)情況 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs計(jì)數(shù)及其活力比較見(jiàn)表1、2。膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs培養(yǎng)第36、48、60、72 h細(xì)胞活力明顯高于組織塊貼壁法同時(shí)間(P均<0.05)。

表1 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs計(jì)數(shù)比較

注：與組織塊貼壁法培養(yǎng)同時(shí)間比較，*P<0.01。

表2 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs細(xì)胞活力比較±s)

注：與組織塊貼壁法培養(yǎng)同時(shí)間比較，*P<0.05。

2.2 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs細(xì)胞周期比較 膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs G1、G2、S期細(xì)胞分別占(80.44±1.32)%、(6.56±0.68)%、(11.24±3.71)%，組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs G1、G2、S期細(xì)胞分別占(80.69±1.47)%、(5.33±1.18)%、(13.77±0.29)%。兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11、SP-1、OPN mRNA表達(dá)比較 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11、SP-1、OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs中α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于組織塊貼壁法， OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于組織塊貼壁法(P均<0.05)。

表3 兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs α-SMA、TAGLN、MYH-11、SP-1、OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與組織塊貼壁法比較，*P<0.05。

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)VSMCs的生物學(xué)特征，尤其是細(xì)胞增殖、分化、調(diào)亡和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)影響等方面研究的不斷深入，其表型轉(zhuǎn)化在各種疾病中作用的研究正越來(lái)越受到人們關(guān)注。由于在表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中，VSMCs的各種特性會(huì)發(fā)生明顯變化，并且對(duì)血管壁微環(huán)境也有顯著影響，而這些表型及生物學(xué)功能的改變與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓等多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。

VSMCs來(lái)自胚胎發(fā)育時(shí)期的中胚層，由胚胎時(shí)期的合成表型逐漸分化為具有成年特征的收縮表型，進(jìn)而構(gòu)成成年個(gè)體血管壁的重要組分，其組織學(xué)功能主要是保持血管壁的彈性和維持血管壁的張力。收縮表型的VSMCs多呈梭形或帶狀，其增殖、遷移能力差或無(wú)[14]。而在某些病理生理因素，如炎癥、應(yīng)激及環(huán)境改變等刺激下，VSMCs會(huì)向分泌表型轉(zhuǎn)化，由于分泌表型的VSMCs主要存在于胚胎時(shí)期，與細(xì)胞增殖、遷移等多種功能密不可分[15]。因此，在某些病理?xiàng)l件刺激下，合成表型的VSMCs增多會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、重構(gòu)、彈性降低等一系列病理改變，從而誘發(fā)各類(lèi)心血管疾病的發(fā)生[16]。

經(jīng)典的VSMCs原代培養(yǎng)方法主要有組織塊貼壁法和膠原酶消化法，針對(duì)兩種不同的細(xì)胞分離方法進(jìn)行鑒定，證實(shí)兩種方法均能便捷、高效地分離VSMCs[9，10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法分離、培養(yǎng)的原代平滑肌細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察均呈梭形并形成特征性的“峰—谷”狀生長(zhǎng)，α-actin免疫熒光染色鑒定獲得純度>95%的RASMCs。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的傳2代RASMCs培養(yǎng)36～72 h細(xì)胞增殖較快；而組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的傳2代RASMCs培養(yǎng)24～60 h細(xì)胞增殖較快，培養(yǎng)72 h后進(jìn)入停滯期。由此可見(jiàn)，在傳2代RASMCs中，膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs增殖速度較組織塊貼壁法明顯減慢。而對(duì)傳3代的RASMCs進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs在傳3代后細(xì)胞增殖能力均較高。

以上結(jié)果可能是由多種原因造成的，我們推測(cè)可能與VSMCs的表型變化有關(guān)[17,18]。文獻(xiàn)報(bào)道，在某些刺激因素的作用下，收縮表型的VSMCs會(huì)向合成表型轉(zhuǎn)化，以適應(yīng)細(xì)胞損傷及內(nèi)環(huán)境改變等[19]。本研究觀察了兩種方法分離、培養(yǎng)的RASMCs收縮表型和合成表型標(biāo)志基因變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs中收縮表型標(biāo)志基因α-SMA、TAGLN、MYH-11 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于組織塊貼壁法，合成表型標(biāo)志基因OPN mRNA相對(duì)表達(dá)量低于組織塊貼壁法。其中，α-SMA是國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)的VSMCs重要標(biāo)志，并可作為其收縮表型的重要標(biāo)志物[20～22]。說(shuō)明膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs在培養(yǎng)過(guò)程中保持著收縮表型，成活率高，增殖較慢，而組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs具有向合成表型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。

綜上所述，膠原酶消化法、組織塊貼壁法均可在體外分離、培養(yǎng)RASMCs。膠原酶消化法分離、培養(yǎng)的RASMCs在培養(yǎng)過(guò)程中保持著收縮表型，成活率高，增殖較慢；組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的RASMCs生長(zhǎng)、增殖較快，具有向合成表型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。因此，在針對(duì)以VSMCs為靶細(xì)胞的疾病研究時(shí)采用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)獲得的細(xì)胞更佳。

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徐志云(E-mail： zhiyunx@hotmail.com)

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2016- 09-19)