陳 萍，李盼畔，麥麗珊，劉姣姣，何翠霞，趙淑嘉，吳小瑤，陳 穎

(南沙出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東 廣州 511400)

DNA分子標(biāo)記技術(shù)及其在啤酒大麥品種鑒定中的應(yīng)用

陳 萍，李盼畔，麥麗珊，劉姣姣，何翠霞，趙淑嘉，吳小瑤，陳 穎

(南沙出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，廣東 廣州 511400)

簡單對比了常用的大麥品種鑒定方法以及歸納DNA分子標(biāo)記技術(shù)的分類，進一步通過綜述幾種常用 DNA分子標(biāo)記技術(shù)的原理、優(yōu)缺點及其在大麥品種及純度鑒定上的應(yīng)用情況，以期為DNA分子標(biāo)記在啤酒大麥品種及純度鑒定研究提供參考。

DNA分子標(biāo)記；啤酒大麥；品種鑒定

啤酒大麥?zhǔn)瞧【粕a(chǎn)的主要原料，大麥的質(zhì)量直接影響啤酒的品質(zhì)和口感；而大麥的質(zhì)量受品種、產(chǎn)區(qū)、氣候條件等因素的影響，大麥不同品種之間的淀粉、蛋白質(zhì)、β-葡聚糖以及酶系活性等均存在一定差異，這些差異直接影響麥芽制造和啤酒釀造工藝。因此，大麥品種的真實性及純度是啤酒釀造的關(guān)鍵。

目前，我國已成為世界上最大的啤酒生產(chǎn)國[1]。隨著我國啤酒產(chǎn)量的不斷增長，國產(chǎn)大麥產(chǎn)量及質(zhì)量難以滿足市場需求，啤酒大麥的進口量迅猛增長，位列進口谷物前3位，2013～2014年度進口量達到歷史最高的489.1萬t[2]。近年來，我國啤酒大麥進口國主要為澳大利亞、加拿大和法國；其中，澳麥的品種主要有g(shù)airdner、baudin、vlamingh等，加麥的品種主要有metcalfe、copland、major等，法麥的品種主要有sebastian、tipple、cerviose等。在國際貿(mào)易中，大麥品種是優(yōu)質(zhì)優(yōu)價的，不同品種的每噸價格相差數(shù)十美元；一般情況下，買賣雙方在貿(mào)易合同中對大麥品種以及品質(zhì)指標(biāo)等進行標(biāo)注和規(guī)定，如果進口大麥出現(xiàn)品種或純度與合同規(guī)定的不符，則會使我國在對外貿(mào)易中蒙受直接的經(jīng)濟損失，也間接給啤酒釀造業(yè)帶來經(jīng)濟損失。因此，品種鑒定是進口大麥品質(zhì)檢驗中很重要的項目指標(biāo)。另外，在國內(nèi)市場上，由于生產(chǎn)和經(jīng)營管理不規(guī)范等因素，啤酒大麥出現(xiàn)以次充好等摻假情況，嚴(yán)重影響了我國啤酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。因此，開展品種鑒定工作對于避免貿(mào)易經(jīng)濟損失、保證啤酒大麥質(zhì)量及提高啤酒釀造業(yè)的生產(chǎn)效益等方面具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外對大麥品種的真實性及純度鑒定技術(shù)研究在不斷發(fā)展，在簡要比較常用的大麥品種鑒定方法的基礎(chǔ)上，進一步對DNA分子標(biāo)記技術(shù)中常用的RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP標(biāo)記的原理及其在大麥品種及純度鑒定上的應(yīng)用作一簡述，為大麥品種及純度鑒定技術(shù)選擇及研究提供一些參考。

1 大麥品種鑒定方法的比較

種子品種及純度的鑒定方法來源于遺傳標(biāo)記，目前在大麥品種鑒定工作應(yīng)用較為廣泛的遺傳標(biāo)記主要有形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記3種類型。

形態(tài)標(biāo)記，即感官鑒定，是最常用的物種鑒定方法。利用種子的外部形態(tài)特征(如籽粒形狀、顏色、麥芒等)來進行品種鑒定，如我國國標(biāo)《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定》(GB/T 3543.5-1995)對大麥種子品種的形態(tài)鑒定標(biāo)記進行了規(guī)定；澳大利亞谷物貿(mào)易協(xié)會每年頒布的大麥品種標(biāo)準(zhǔn)中提供具體的標(biāo)準(zhǔn)樣品圖片及品種的形態(tài)鑒定特征。形態(tài)標(biāo)記雖然簡單、方便、直觀，但在實際運用中，大麥品種繁多，不同品種間形態(tài)差異不明顯，檢驗結(jié)果存在主觀誤差及準(zhǔn)確性不高。

生化標(biāo)記主要基于種子同工酶和貯藏蛋白如醇溶蛋白的電泳技術(shù)。同工酶電泳技術(shù)穩(wěn)定性好、重復(fù)率高，但可利用的同工酶數(shù)量少、多態(tài)性低，該技術(shù)應(yīng)用于大麥品種鑒定有其局限性。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)如醇溶蛋白-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(SDS-PAGE)近年來被廣泛運用于大麥品種鑒定，中國、歐洲啤酒協(xié)會(簡稱EBC)等將其列入標(biāo)準(zhǔn)方法；但該技術(shù)存在數(shù)據(jù)庫不完整，檢測時染色效果差，條帶圖像不容易判別等問題，而且對復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品及親緣關(guān)系較近的品種，很難區(qū)分出來，逐漸體現(xiàn)出不適應(yīng)市場的需求。

DNA分子標(biāo)記是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)而發(fā)展起來的一種遺傳標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記等相比，具有許多獨特的優(yōu)點：不受組織類別、發(fā)育階段等影響，不受環(huán)境影響，標(biāo)記數(shù)量多，具有較高的多態(tài)性等等。DNA分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)幾十種，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物、農(nóng)學(xué)等眾多領(lǐng)域，這些技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為大麥品種及純度鑒定工作提供了更多的研究手段。

2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)的分類

根據(jù)DNA分子標(biāo)記的技術(shù)原理以及發(fā)展歷史，DNA分子標(biāo)記可被分為3類[3]：

(1)以southern雜交技術(shù)為核心，其中限制性片段長度多態(tài)性( restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)為代表；該類技術(shù)的運用研究主要集中在上世紀(jì)八、九十年代。

(2)以PCR技術(shù)為核心，該類型的分子標(biāo)記是從上世紀(jì)八十年代中期發(fā)展起來，其中，研究運用較為廣泛的技術(shù)主要包括RAPD ( random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA) ，AFLP( amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)、SSR ( simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列)等等。

(3)以SNP ( single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，為新型分子標(biāo)記，是目前生物學(xué)研究的熱點。SNP檢測技術(shù)主要包括兩大類，即基于凝膠電泳的SNP檢測方法，如酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS，又稱PCR-RFLP)等；高通量的SNP檢測方法，如測序、DNA芯片等。

3 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在大麥品種鑒定的應(yīng)用

3.1RFLP標(biāo)記技術(shù)

RFLP是1974年Grodzicker等發(fā)明，是最早發(fā)展起來的第一代分子標(biāo)記方法。

RFLP的原理是利用特定的限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，用特異性探針進行southern雜交，進而將與探針同源的酶切片段在長度上的多態(tài)性呈現(xiàn)出來。RFLP技術(shù)具有多態(tài)性穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點，該技術(shù)在上世紀(jì)八、九十年代多運用于物種的基因圖譜繪制研究工作中。如首張大麥圖譜是由Heun等4]在1991年利用procter×nudinka雜交F1代113個株系DH群體進行RFLP標(biāo)記，并得到157個標(biāo)記；Hintum等[5]利用RFLP分子標(biāo)記系統(tǒng)構(gòu)建了歐洲春季大麥的核心種質(zhì)圖譜并進行了比較。在大麥品種鑒定技術(shù)研究方面，RFLP相關(guān)的技術(shù)研究鮮有報道。

由于RFLP技術(shù)存在操作繁瑣、靈敏度低、成本高、DNA用量大、試劑對人體有害等方面的劣勢，該方法不適于進行大批量品種鑒定，在實際應(yīng)用中受到限制。

3.2RAPD標(biāo)記技術(shù)

RAPD是在 1990年由Williams和Welsh同時研發(fā)的檢測技術(shù)，該技術(shù)的原理是以樣品DNA為模板，利用隨機引物進行PCR擴增，然后利用凝膠電泳檢測DNA序列多態(tài)性。

RAPD技術(shù)具有操作簡便、成本低、DNA 用量少等優(yōu)點，被廣泛用于品種及純度鑒定、基因定位和基因克隆等多方面研究。國內(nèi)外利用RAPD技術(shù)開展大麥品種鑒定的研究比較多，如：早在1998年Davila等[6]用RAPD技術(shù)對70份歐洲大麥和29份野生二棱大麥進行了分析，結(jié)果表明,這些品種可按生長習(xí)性和穗型分類；Hanif等[7]利用RAPD鑒定出10種來源不同的野生大麥；黃祥斌等[8]采用RAPD對北美的5種二棱啤酒大麥和11種六棱啤酒大麥進行了品種鑒定分析；吳亞君等[9]采用 RAPD-毛細(xì)管芯片電泳法對19 個啤酒大麥品系進行鑒定，區(qū)分得到13個組，包括8個單獨的品系和5個品系組合。

但RAPD技術(shù)存在著不足：穩(wěn)定性及重復(fù)性較差、易受各種因素的影響，另外，在用于二倍體作物研究時，不能有效區(qū)分純合基因型和雜合基因型。該技術(shù)在廣泛運用中也得到了不斷的完善，如被轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。

3.3AFLP標(biāo)記技術(shù)

AFLP是1992年由Zzbeau和Vos發(fā)明的一項具有專利的分子標(biāo)記技術(shù)，實質(zhì)是 RFLP和 PCR技術(shù)的結(jié)合。其原理是對樣品基因組DNA雙酶切的產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增，然后將擴增后的限制性片段通過凝膠電泳技術(shù)檢測DNA序列多態(tài)性。

AFLP具有多態(tài)性高、分辨率高等優(yōu)勢，AFLP技術(shù)在大麥品種鑒定研究中也有運用。谷方紅等[10]采用AFLP技術(shù)，從20對引物中篩選出3對多態(tài)性較強的引物，結(jié)果表明，通過2～3對引物即可區(qū)分11個釀造型大麥品種；初雷[11]利用AFLP技術(shù)對27種國內(nèi)外釀造大麥品種進行鑒定研究，篩選出3對帶型清晰、多態(tài)性較高的引物組合。

但由于操作繁瑣，對試驗技能要求較高，試驗周期較長，對DNA質(zhì)量要求很高，AFLP技術(shù)難以在種子純度鑒定中獲得廣泛應(yīng)用[12]。

3.4SSR標(biāo)記技術(shù)

SSR即簡單序列重復(fù)，又稱為微衛(wèi)星 DNA(microsatellite DNA)，是一類由幾個核苷酸為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR 標(biāo)記技術(shù)的原理是根據(jù)SSR兩側(cè)的序列相對保守的特性，設(shè)計特異引物進行PCR擴增，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)目的差異檢測多態(tài)性。

SSR標(biāo)記對 DNA需求量少，多態(tài)性高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，已在多種農(nóng)作物的品種及純度鑒定中得到應(yīng)用。在大麥品種鑒定方面，如Russel等[13]僅用11個SSR標(biāo)記就區(qū)分了包括相同系譜來源在內(nèi)的24個大麥基因型，并利用4對SSR標(biāo)記區(qū)分這24種大麥品種。楊振華[14]對35個啤酒大麥品種進行SSR擴增分析，擴增帶清晰，具有多態(tài)性且穩(wěn)定。近年來，SSR標(biāo)記結(jié)合EST技術(shù)，在大麥品種鑒定研究中也得到了應(yīng)用，如張利莎等[15]利用EST-SSR技術(shù)對4種大麥麥芽的純度進行了鑒定，結(jié)果表明,EST-SSR標(biāo)記能定性檢測混雜度高于10%的麥芽樣品。

SSR技術(shù)既有RFLP的穩(wěn)定性和共顯性的優(yōu)點，又比 RAPD 標(biāo)記成本低，技術(shù)簡單。但是，SSR 標(biāo)記技術(shù)也存在一些不足：新的引物開發(fā)成本高且有一定的難度，同時 SSR 標(biāo)記檢測所用標(biāo)記數(shù)是影響鑒定效率和成本的一個關(guān)鍵因素。

3.5SNP分子標(biāo)記技術(shù)

1996 年， Lander首次提出 SNP標(biāo)記技術(shù)，是第三代分子標(biāo)記。SNP 是指由單個核苷酸的變異而導(dǎo)致的 DNA 序列多態(tài)性。目前，針對SNP標(biāo)記的檢測手段主要有：CAPS(酶切擴增多態(tài)性序列)、AS-PCR(等位基因特異性PCR)、KASP(競爭性等位基因特異性PCR)、測序、質(zhì)譜檢測法、HRM(高分辨率溶解曲線)。

SNP 標(biāo)記具有數(shù)量豐富、穩(wěn)定性好、高通量和高度自動化等優(yōu)點。目前，利用SNP標(biāo)記在大麥品種鑒定的研究已有相關(guān)報道。Pattemore等[16]運用基于MALDI-TOF質(zhì)譜分析的SNP檢測方法，能高效區(qū)分澳大利亞的大麥品種；張利莎等[15]利用基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記對大麥麥芽的純度進行了檢測，結(jié)果表明，SNP標(biāo)記能夠有效鑒定混雜度低至5%的麥芽樣品；徐東東[17]等也利用基于KASP技術(shù)的SNP標(biāo)記對大麥麥芽的純度進行了檢測，并同時結(jié)合品質(zhì)分析，結(jié)果表明，兩種方法的聯(lián)合分析，能快速確定麥芽的真實性和純度。

SNP標(biāo)記在篩選有效的SNP以及結(jié)果數(shù)據(jù)分析等方面還存在困難，但隨著SNP分子標(biāo)記檢測技術(shù)的應(yīng)用和完善，其在品種鑒定研究中將發(fā)揮更大的作用。

4 展望

DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、不受環(huán)境因素影響等特點，為物種鑒定提供了一種更為有效和可靠的方法。啤酒大麥品種的真實性及純度的鑒定工作無論在貿(mào)易或生產(chǎn)上，都是很關(guān)鍵和基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，不斷完善啤酒大麥品種鑒定技術(shù)體系，并且能使該技術(shù)體系標(biāo)準(zhǔn)化，廣泛運用到實際貿(mào)易和生產(chǎn)中，對于保障啤酒大麥的質(zhì)量具有重要意義。

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(責(zé)任編輯：趙琳琳)

降低農(nóng)作物鎘超標(biāo)概率途徑被發(fā)現(xiàn)

日前，中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室陳衛(wèi)平研究組在農(nóng)作物鎘污染研究方面取得新進展。研究結(jié)果近日發(fā)表在美國化學(xué)學(xué)會旗下的《農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)》期刊上。

農(nóng)作物鎘污染是當(dāng)前國內(nèi)外關(guān)注的主要問題之一，定量化各環(huán)境因子對農(nóng)作物鎘累積的影響程度對區(qū)域鎘污染風(fēng)險調(diào)控至關(guān)重要。目前實驗室規(guī)模的影響因子解析和調(diào)控手段難以指導(dǎo)實際應(yīng)用。

陳衛(wèi)平研究組從“土壤-土壤溶液-作物吸收”概念出發(fā)，通過對湖南攸縣蔬菜和水稻鎘富集水平的長期觀測，揭示了鎘固液分配系數(shù)(Kd)和農(nóng)作物鎘富集因子(PUF)變化特征及其主要影響因子，并結(jié)合大田實驗和模型模擬進行驗證和風(fēng)險評估。研究發(fā)現(xiàn)，改善土壤酸化和恢復(fù)土壤微量元素平衡可顯著降低區(qū)域農(nóng)作物鎘超標(biāo)概率。該研究為我國農(nóng)作物鎘污染現(xiàn)狀改善和風(fēng)險管理提供了科學(xué)方法和理論依據(jù)。

(摘自ZGSPAQB,2017-07-18)

DNAmolecularmarkeranditsapplicationinidentificationofseedvarietiesofbeerbarley

CHEN Ping，LI Pan-pan，MAI Li-shan，LI Jiao-jiao， HE Cui-xia，ZHAO Shu-jia,WU Xiao-yao，CHEN Ying

(Nansha Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau Comprehensive Technical Service Center，Guangzhou 511400,China)

We briefly analyzed the commonly used methods in the identification of barley seed varieties, then reviewed the principles,advantages and disadvantages and research status of several commonly used molecular marker technologies in the variety and the purity identification of barely, in order to provide references for the DNA molecular marker research in this field.

DNA molecular marker；beer barley；identification of seed varieties

2017-03-15；

2017-07-20

廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(2016GDK41)。

陳 萍(1978-),女，高級農(nóng)藝師，研究方向為品質(zhì)檢驗。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.08.015

S503.3;S512.3+1

：A

：1003-6202(2017)08-0063-04