張 麗，董麗君，劉 琳，許美玲，楊 娟，杜 震

(1.山東臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 臨沂 276034； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中3種異噻唑啉酮

張 麗1，董麗君1，劉 琳2，許美玲1，楊 娟1，杜 震1

(1.山東臨沂出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 臨沂 276034； 2.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 青島 266001)

建立了測(cè)定飼料中3種異噻唑啉酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。以甲醇為提取劑，超聲法提取30 min，離心后濃縮定容，上機(jī)檢測(cè)。用Eclipse Plus C18色譜柱進(jìn)行分離，以30%甲醇和70%的去離子水為流動(dòng)相，等梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式進(jìn)行定性分析。方法回收率在75.8～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.63%～5.75%。操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于飼料中異噻唑啉酮的檢測(cè)。

飼料；異噻唑啉酮；超聲提??；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

飼料安全是動(dòng)物性食品安全的基礎(chǔ),是關(guān)乎食品安全的大事，是全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。我國(guó)現(xiàn)階段飼料安全工作仍存在以下問題：一是飼料標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)滯后。相對(duì)于發(fā)達(dá)國(guó)家的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中監(jiān)管項(xiàng)目偏少。新的農(nóng)藥、獸藥、添加劑以及防腐劑等的不斷出現(xiàn)，測(cè)定方法及測(cè)定儀器靈敏度的不斷提高，也使得對(duì)現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的覆蓋面及有毒有害物質(zhì)限量的規(guī)定提出了新的要求。二是缺少通用性強(qiáng)、權(quán)威性高的飼料中違禁藥物和添加劑的檢測(cè)方法。目前，各地違禁藥品檢測(cè)大多使用國(guó)外或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，方法不一致，對(duì)比性差，有些違禁藥物甚至沒有針對(duì)性的檢測(cè)方法，因此，亟需制定國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。異噻唑啉酮類化合物具有抗菌能力強(qiáng)、應(yīng)用劑量小、相容性好、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等性能，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)公告，異噻唑啉酮類藥物不在飼料添加劑品種目錄中，屬于違禁藥物。通過查閱文獻(xiàn)，飼料中異噻唑啉酮檢測(cè)的研究尚屬空白，因此，有必要建立相應(yīng)的分析方法，為飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定和修改以及飼料中違禁藥品和添加劑的檢測(cè)提供技術(shù)支持。

目前涉及異噻唑啉酮的測(cè)定的產(chǎn)品很多，主要有食品接觸材料、水、紡織品、皮革、化妝品、環(huán)境樣品、玩具等方面[3]。檢測(cè)的方法主要有碘量法[4]、氣相色譜法[5]、液相色譜法等[6]。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)[7]快速發(fā)展，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于化妝品、環(huán)境等領(lǐng)域水相樣本中異噻唑啉酮類化合物含量的檢測(cè)。與氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-紫外檢測(cè)相比，LC-MS/MS更加適合于復(fù)雜體系中異噻唑啉酮的測(cè)定，而且分析時(shí)間短，靈敏度高，因此受到了廣泛的關(guān)注。

本文采用超聲萃取，樣品前處理方法簡(jiǎn)單，方法快捷，回收率高，檢出限低，填補(bǔ)了飼料中異噻唑啉酮檢測(cè)的空白。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

甲醇：色譜純；丙酮：色譜純；乙酸乙酯：分析純；乙醇：分析純；3種異噻唑啉酮均購(gòu)于德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司，2-甲基-4異噻唑啉-3酮MI：純度≥98.0%；5-氯-2甲基-4異噻唑啉-3酮CMI：純度≥99.0%；1,2苯并異噻唑啉-3酮BIT：純度≥99.5%；地瓜干顆粒飼料等。

表1 異噻唑啉酮種類表

1.2試驗(yàn)設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1200快速液相色譜儀，6410 Triple Quad 質(zhì)譜儀；超聲波提取器：SK8200H；均質(zhì)器：ULTRA-TURRAX T25；離心機(jī)：Eppendorf CR22GⅢ；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：chiller F100；乙二胺-N-丙基硅烷吸附柱：SAX PSA；渦流混勻器：IKA MS3基本型；超純水器：Milli-Q；電子天平：感量0.001；塑料離心管：50 ml；圓底燒瓶：100 ml；燒杯：1 000 ml；錐形瓶：具磨口塞100 ml；0.22 μm有機(jī)濾膜；移液槍：Eppendorf 1 000 μl、5 ml、10 ml。

2 試驗(yàn)方法

2.1樣品前處理

準(zhǔn)確稱取粉碎后檢測(cè)用樣品1.00 g(精確至0.01 g)置于100 ml磨口燒瓶中，加入20 ml甲醇，超聲提取30 min，收集上清液至離心管中，加入10 ml甲醇二次超聲提取10 min，合并上清液。以5 000 r/min離心5 min，(必要時(shí)過PSA小柱)轉(zhuǎn)移至雞心瓶中旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容至5 ml，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)定。

2.2色譜質(zhì)譜條件

通過查閱文獻(xiàn)和對(duì)不同碰撞能和出口電壓下檢測(cè)結(jié)果的比較，得出能保證色譜測(cè)定時(shí)被測(cè)組分能夠得到有效的分離的參數(shù)。液相色譜條件：

(1)色譜柱： Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。

(2)流動(dòng)相：A為甲醇溶液30%，B為去離子水70%，等梯度洗脫。

(3)色譜柱溫：35℃。

(4)進(jìn)樣體積：5 μl。

(5)離子源：ESI，正離子掃描。

(6)霧化器壓力：310 kPa。

(7)毛細(xì)管電壓：4 000 V。

(8)掃描方式：MRM。

(9)檢測(cè)離子對(duì)、毛細(xì)管出口電壓/碎裂電壓、碰撞能等質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜采集參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1色譜條件的選擇

由于三種異噻唑啉酮均具有一定的極性，選擇對(duì)極性樣品具有較好保留值和分離度的Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)色譜柱，通過查閱文獻(xiàn)[7]用甲醇/去離子水作為流動(dòng)相洗脫，分離效果較好?？疾炝思状肌盟壤秊?5%∶85%、20%∶80%、30%∶70%、50%∶50%等梯度洗脫時(shí)出峰情況，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水比例為30%∶70%時(shí)峰形尖銳、出峰時(shí)間和出峰效果最好，見圖1。

1.2甲基-4異噻唑啉-3酮;2.5-氯-2甲基-4異噻唑啉-3酮; 3.1,2苯并異噻唑啉-3酮

3.2樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取粉碎后檢測(cè)用樣品1.00 g(精確至0.01 g)，考察了甲醇、丙酮、乙酸乙酯、去離子水4種不同極性的溶劑，振蕩萃取3～4 h，收集上清液至離心管中，離心、過PSA凈化小柱、旋蒸后定容至5 ml，在上述色譜質(zhì)譜條件下測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 不同極性溶劑萃取結(jié)果

由表3可知。，甲醇萃取效果最好，丙酮和乙酸乙酯次之，綜合考慮萃取效果、試劑價(jià)格和毒性，研究采用甲醇作為萃取溶劑。

3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用甲醇配制濃度均為100 mg/L的MI，CMI，BIT混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，做為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇配制成10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液，用樣品空白處理液逐級(jí)稀釋濃度為0.05、0.1、0.5、1、2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜質(zhì)譜條件下測(cè)定，結(jié)果表明MI，CMI，BIT在0～2.0 mg/L線性范圍內(nèi)三種異噻唑啉酮的質(zhì)量濃度與響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如表4所示。

以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N=3和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出檢出限(LOD),信噪比S/N=10和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出定量限(LOQ)。

表4 三種異噻唑啉酮的線性關(guān)系與檢出限

3.4回收率和精密度

對(duì)方法做3水平6平行的添加回收試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

由表5可知：平均回收率75.8%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.63%～5.75%，所建方法重復(fù)性較好，回收率滿意。

表5 回收率和精密度

3.5實(shí)際樣品檢測(cè)

為了將此方法應(yīng)用于飼料的檢測(cè)，進(jìn)一步測(cè)試此方法的適用性，我們隨機(jī)對(duì)幾個(gè)飼料樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)情況見表6。

表6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：個(gè)別飼料中MI和BIT有少量檢出，CMI均為未檢出。

4 結(jié)論

綜上所述，我們建立了一種同時(shí)測(cè)定飼料中三種異噻唑啉酮的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，以甲醇為萃取溶劑，采用超聲萃取對(duì)飼料中的異噻唑啉酮進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)處理后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。該方法較簡(jiǎn)便快速、定性準(zhǔn)確、靈敏度高，填補(bǔ)了飼料中異噻唑啉酮檢測(cè)的空白。

[1] 馬宣宣，張洪濤，趙 君，等．異噻唑啉酮類衍生物的合成及其抗菌效應(yīng)[J]．中國(guó)涂料，2012，27(5)：47-50．

[2] 劉鐵巖，張聰敏，王興民，等．異噻唑啉酮衍生物的應(yīng)用：中國(guó)，1236542[P]．1999-12-01.

[3] 周 曉,李小蘭,陳志燕,等.高效液相色譜法測(cè)定水基膠黏劑中3 種異噻唑啉酮類殺菌劑[J].色譜，2015，33:75-79.

[4] European standard prEN 71-11：2005.safety of Toys-Part 11：Organic Chamical Compounds-Methods of Analysis[S].

[5] 陳安東,吳兆偉,余 倩,等.GC/MS法同時(shí)分析液體制劑及口服液型保健品中31種防腐劑和抗氧化劑[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2014,35:438-446.

[6] 趙美麗.HPLC法測(cè)定化妝品中的甲基異噻唑啉酮及其氯代物[J].江西化工,2013(4):188-195.

[7] 楊榮靜,衛(wèi)碧文,于文佳,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)玩具中的3種異噻唑啉酮類防腐劑[J].色譜，2011,29:513-516.

(責(zé)任編輯：梅竹)

Determinationof3isothiazolinonesinfeedstuffusingliquidchromatography-tandemmassspectrometry

Zhang Li ，Dong Li-jun，Liu Lin ，Xu Mei-ling，Yang Juan，Du Zhen

(1.Shangdong Linyi Entry Inspection and Quarantine Breau,Linyi 276034,China;2. Shangdong Entry Inspection and Quarantine Breau,Qindao 266001,China)

A method for determination of 3 isothiazolinones in feedstuff was developed by LC-MS/MS.The samples was extracted by ultrasonic for 30 min,the extract was centrifuged and the concentrate was diluted,and then determined by LC-MS/MS. The HPLC was carried out on Eclipse Plus C18column,the mobile phase was 30% methanol and 70% deionized water with gradient elution. The mass spectrometer was operated in a multiple reaction monitoring (MRM) mode. The recovery rate was distributed in the range of 75.8%-102% and the RSD was distributed in the range of 1.63%-5.75%.The method was simple and accurate,which could be used in the determination of the residues of isothiazolinones in feedstuff.

feedstuff;isothiazolinone;ultrasonic extraction;LC-MS/MS

2017-05-23；

2017-07-18

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目“液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè)飼料中異噻唑啉酮類防腐劑方法研究”(SK201460)。

張 麗(1981-)，女，高級(jí)工程師。主要從事實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.08.013

S816.17

：A

：1003-6202(2017)08-0055-04