郭義紅　孫威江　林偉東

摘要：DNA條形碼技術(shù)是近幾年迅速發(fā)展的一種基于分子水平的物種鑒定技術(shù)，基本原理是根據(jù)不同物種間特定基因片段的序列差異，利用生物信息學(xué)技術(shù)對物種進行快速分類和鑒定，在植物的物種鑒定中已有較廣泛的應(yīng)用。本文從植物DNA條形碼鑒定的步驟、DNA條形碼在植物鑒定中的研究進展方面進行綜述，并提出DNA條形碼技術(shù)在植物中應(yīng)用的一些展望。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；植物；品種鑒定

中圖分類號： S571.101 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0019-03

常用的植物鑒定方法有表型鑒定和分子水平鑒定。由于生長環(huán)境、加工方式的差異，植物外觀形態(tài)出現(xiàn)較大變化，因此在實際應(yīng)用中很難通過表現(xiàn)型對其進行物種鑒定。DNA是一種穩(wěn)定的生物大分子，利用DNA分子水平的鑒定方法能準(zhǔn)確有效地對新鮮和加工過的植物樣品進行鑒定，避免表型鑒定造成的誤差和生化檢測的繁雜操作。目前常用的DNA鑒定方法有DNA指紋圖譜技術(shù)、DNA芯片技術(shù)和DNA條形碼技術(shù)等。DNA條形碼技術(shù)是利用一段短而標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列作為標(biāo)記來實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動化物種鑒定的方法，是由加拿大的動物學(xué)家Herbert在2003年提出的[1]，經(jīng)過多年的發(fā)展DNA條形碼技術(shù)在分子系統(tǒng)發(fā)育、進化生態(tài)學(xué)[2]等研究和動植物品種、食品組成[3]、法醫(yī)物證等鑒定中有廣泛的應(yīng)用。

1 植物DNA條形碼鑒定的步驟

1.1 植物DNA提取

提取一定濃度和純度的DNA是完成植物DNA條形碼研究的前提。目前常用的植物DNA提取方法有CTAB法、SDS法、高鹽低pH值法和試劑盒法等，在提取植物樣品DNA前，應(yīng)針對其特異性選擇合適的DNA提取方法。對于新鮮的植物樣品，一般采用傳統(tǒng)的CTAB法或者常規(guī)的植物DNA提取試劑盒提取即可得到一定質(zhì)量的植物樣品DNA。對于干燥或者經(jīng)特殊處理過的植物樣品，則須根據(jù)樣品的特性對傳統(tǒng)的方法進行改良。劉少峰利用CTAB法、CTAB法聯(lián)用試劑盒法和試劑盒法分別提取沉香的總DNA，結(jié)果表明CTAB法聯(lián)合試劑盒法提取的DNA，經(jīng)PCR擴增后目的片段的產(chǎn)率最高，且方法簡單、快速[4]。Costa等利用改良的試劑盒法提取植物性滋補品和茶葉的總DNA[5-6]，Arolla等對CTAB法進行改良[7-8]，成功提取出穿心蓮屬和黏液質(zhì)種子的總DNA，DNA濃度均較高且電泳條帶清晰。

1.2 陸地植物通用的DNA條形碼序列選擇

生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）作為全球DNA條形碼研究的權(quán)威機構(gòu)，在綜合以往研究和工作組所提供數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，建議將葉綠體基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼[9-10]。

1.2.1 rbcL序列 rbcL片段在GenBank中有大量的序列數(shù)據(jù)，并且具有通用、易擴增、易比對的特點，因而被提議作為條形碼片段，但是rbcL的變異主要存在于種以上水平，物種水平上通常變異不夠大。此外，rbcL的整體長度較長（至少 1 300 bp），給整個基因的測序帶來了困難。

1.2.2 matK序列 與其他編碼區(qū)片段相比，matK片段的進化速率較快，但該片段的引物通用性較差，鑒定不同類群時往往需要設(shè)計不同的引物，其引物通用性和擴增成功率有待進一步檢驗，適用于種屬水平的物種鑒別。

1.2.3 trnH-psbA序列 trnH-psbA片段作為植物DNA條形碼最大的優(yōu)勢是進化速率快，但同時也由于插入/缺失過多引起了較高的突變率和簡單的序列重復(fù)和重排，在進行序列分析時需要輔以人工校正，而給非同屬物種間的比對帶來了較大困難。不過，比對容易與否并不是條形碼必需的條件，一旦建立恰當(dāng)?shù)臈l形碼數(shù)據(jù)分析方法，插入/缺失還將會增加物種識別所需要的信息。

1.2.4 ITS序列 ITS片段在物種水平上變異較大，且已廣泛應(yīng)用于物種分類及系統(tǒng)進化研究，然而擴增成功率是ITS作為條形碼應(yīng)用的一個限制因素，主要表現(xiàn)為：其長度變異大，多數(shù)物種擴增片段長度超過1 100 bp，需要使用中間引物才能擴增獲得整個基因，且存在長的poly結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致測序和序列分析困難。另外，核基因本身存在多拷貝的特性，在種內(nèi)序列變異較大，進一步降低了該片段作為條形碼的應(yīng)用性[9，11-12]。

除了以上這4種DNA條形碼序列，trnL、rpoC1、rpoB、ndhJ等DNA片段也常作為植物的DNA條形碼序列[13]，另外，將不同的DNA片段進行組合可提高DNA條形碼的鑒定能力[14-5]。

1.3 植物DNA條形碼數(shù)據(jù)分析

將特定序列PCR擴增后的產(chǎn)物回收、純化、測序，即得到植物樣本的目的基因序列，此時須對其進行人工校正再使用序列處理軟件進行拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)[16]。常用序列拼接軟件有CodonCode Aligner V2.06（CodonCode Co. USA）和DNAMAN等。校正拼接后的序列即可進行DNA條形碼的數(shù)據(jù)分析，常用的方法有Blast分析、遺傳距離比較和系統(tǒng)進化關(guān)系的構(gòu)建3種方式[16]。Blast即局部相似性基本查詢工具，是由NCBI開發(fā)的基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序，將待研究序列與DNA序列庫進行比較，即可確定該序列的生物屬性；遺傳距離分析是運用MEGA等軟件工具，采用Kimura-2-Parameter distance（K2P） 或者 pairwise uncorrected p-distance模型來計算種間距離，通過種內(nèi)、種間的差異比較確定種內(nèi)及種間變異的閾值，從而對未知植物樣品進行檢索與鑒定[17-18]；系統(tǒng)進化關(guān)系一般用進化樹來描述，以確定同一譜系植物的進化關(guān)系。

3 DNA條形碼技術(shù)在植物鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 DNA條形碼在中藥材鑒定中的研究

在日常生活和臨床應(yīng)用中，中藥都起著重要的作用，傳統(tǒng)的中藥鑒定方法主要有基元鑒定、形態(tài)鑒定和理化鑒定，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子水平的鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用，而DNA條形碼鑒定的重復(fù)性高、方法通用性強，近年來得到了眾多研究者的關(guān)注[19]。

湯歡等將ITS2作為鑒定涼茶藥材布渣葉及其混偽品的序列，對所取樣品的DNA進行PCR擴增、測序，將測得序列拼接、計算布渣葉及其混偽品的遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)NJ進化樹，結(jié)果顯示基于ITS2序列的DNA條形碼序列可準(zhǔn)確地鑒定布渣葉及其混偽品[20]；黃瓊林等利用rbcL序列成功鑒定出青天葵及其混偽品[21]；王曉明等則利用matK序列有效鑒別出同為豆科的苜蓿、雞骨草和毛雞骨草[22]。而由于中藥材的多樣性，在對中藥進行DNA條形碼鑒定前，通常需要先選擇鑒定該藥材的合適DNA條形碼序列或序列組合。張忠廉等為了篩選一種能高效準(zhǔn)確鑒別千斤撥屬藥用植物的DNA條形碼序列，研究認為ITS可明顯區(qū)分千斤拔屬植物的不同物種，可作為千斤撥藥材基原植物鑒定的條形碼序列[23]。Liu等利用ITS2、psbA-trnH、ITS2與psbA-trnH的組合分別鑒定藥用沙棘和非藥用沙棘，結(jié)果表明ITS與psbA-trnH序列的組合鑒定效果最好[24]。隨著DNA條形碼技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用不斷增多，研究者們也陸續(xù)尋找出鑒定血蝎[25]、金線蓮[26]、檳榔青屬[27]、北沙參[28]等種屬最適的DNA條形碼序列或序列組合。

目前，中藥DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已納入2010版《中國藥典》中。另外相關(guān)書籍如《中藥DNA條形碼分子鑒定》和《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》的出版也標(biāo)志著我國常用中藥材DNA條形碼鑒定技術(shù)已趨于系統(tǒng)化和規(guī)范化[29]，為中藥材的基元鑒定提供了一種科學(xué)規(guī)范的方法。

3.2 DNA條形碼在植物物證鑒定分析中的應(yīng)用

將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于植物物證的鑒定分析中，可避免在案件現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的植物樣本由于破碎、腐敗等原因無法進行形態(tài)學(xué)的辨認，為案件的偵破提供科學(xué)性的證據(jù)[30]。

楊雪瑩等提取了3個可疑毒品樣本的總DNA，利用ITS2引物分別進行擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序，對序列校隊拼接，應(yīng)用Blast方法在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，成功分析了3種新型毒品的植物種屬[31]。宋炳軻等分別用通用引物ITS2和psbA-trnH對5個地區(qū)的60份大麻樣品進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)所有大麻樣本的ITS2擴增片段序列一致，沒有變異；psbA-trnH 擴增片段變異較大，可以區(qū)分5個地區(qū)的大麻樣本[32]。宋炳柯等還利用psbA-trnH成功鑒別出毒品原植物大麻及其混偽品，提供了一種快速準(zhǔn)確鑒定大麻種屬的方法，能有效打擊大麻毒品犯罪[33]。

3.3 DNA條形碼技術(shù)在其他植物鑒定中的作用

由于部分植物種屬內(nèi)形態(tài)變異復(fù)雜，性狀受環(huán)境影響大，往往呈現(xiàn)多樣性，易對屬、組和種類的劃分造成影響，DNA條形碼技術(shù)可快速、準(zhǔn)確鑒定出物種，逐漸在植物的分類鑒定中得到廣泛應(yīng)用。

焦麗娟等利用4個DNA條形碼候選片段對秋海棠屬26種136個個體進行分析，結(jié)果表明ITS/ITS2序列的種內(nèi)和種間變異大，可作為鑒定秋海棠屬的候選序列[34]。張玉宵等運用16個葉綠體DNA片段，對青籬竹族和箣竹族的10個屬22種30個個體進行擴增、測序及變異位點的分析，結(jié)果表明trnG-trnT（t）可作為竹內(nèi)亞科鑒定的DNA條形碼[35]。董洋龍等對11個茶花品種基因組進行了ITS-PCR擴增、多重序列比對及種系發(fā)生等研究，結(jié)果表明11個樣品基因組存在較高的一致性和位點的多態(tài)性，ITS技術(shù)可用于分析茶花樣品間的遺傳關(guān)系[36]。黃衛(wèi)娟利用trnH-psbA、rbcL-a、trnL-F和ITS等4個DNA片段對140份蕎麥及其野生近緣種進行了系統(tǒng)發(fā)育重建，將采集的蕎麥樣品進行了分類，將蕎麥及其野生近緣種和野生型進行了初步區(qū)分，同時對野生種進行了鑒定[37]。Stoeckle等利用matK和rbcL序列對市售的143個茶葉樣品進行了鑒定，結(jié)果表明DNA條形碼技術(shù)也可應(yīng)用于成品茶葉的分類和品種鑒定中[6]。為了能有效地對相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量進行監(jiān)管和生物多樣性的研究，研究者陸續(xù)將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于木材的種屬鑒定中，對樺木屬[38]、楊樹屬[39]、榿木屬[40]等種屬進行了鑒定，均取得了較好的鑒定效果。

4 研究展望

雖然DNA條形碼技術(shù)在中藥中的應(yīng)用已經(jīng)較系統(tǒng)和規(guī)范，在其他植物的鑒定中也有相關(guān)報道，但是研究都不夠深入，相較于其他鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)的認知度相對較低。因此，在今后的研究中，應(yīng)擴大DNA條形碼技術(shù)在其他植物中的應(yīng)用范圍，尋找出最適合各個植物物種的DNA條形碼序列，為今后實現(xiàn)植物物種的快速鑒定奠定基礎(chǔ)。

由于DNA條形碼序列較短，遺傳信息有限[41-43]，在鑒定近緣和近期分化的物種上還存在較大的爭議[17]，與其他分子標(biāo)記結(jié)合，提高DNA條形碼技術(shù)鑒定的效率也是重要的研究方向之一。

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