張競文 燕茹 常越 秦璟

高同型半胱氨酸血癥引起小鼠嗅球細胞損傷的初步探討

張競文1燕茹2常越1秦璟3

目的 探討高同型半胱氨酸血癥損傷神經(jīng)細胞的特點。方法通過高蛋氨酸飲食在ApoE-/-小鼠誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥，采用組織學，組織化學，免疫組化和原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）標記法（TUNEL），對比觀察小鼠嗅球組織結(jié)構(gòu)、尼氏體變化和細胞凋亡。結(jié)果 實驗組血漿總同型半胱氨酸[（23．71±6．30）μmol/L]高于對照組[（6．47±2．66）μmol/L ]（P＜0．05）。在對照組和實驗組，均可見嗅球的基本組織結(jié)構(gòu)，實驗組嗅球組織結(jié)構(gòu)未見明顯的異常。Nissl體染色可見，實驗組Nissl體光密度值明顯低于對照組（P＜0．05）。 NeuN免疫組織化學染色顯示，實驗組NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。實驗組嗅球中TUNEL陽性顆粒細胞數(shù)量明顯多于對照組（P＜0．05）。 結(jié)論 高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)元線粒體損傷和細胞凋亡。

嗅球；細胞凋亡；Nissl體；小鼠；高同型半胱氨酸血癥

高同型半胱氨酸血癥 （hyperhomocysteinemia，HHcy）是臨床上常見的代謝異常之一，與多種人類疾病有關(guān)，是心腦血管疾病獨立的危險因素，與Alzheimer病，Parkinson病，腦萎縮以及其他神經(jīng)變性疾病有密切關(guān)系[1-2]。同型半胱氨酸所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和疾病的作用及其機制尚不清楚。研究提示，同型半胱氨酸可作為興奮性氨基酸，增加神經(jīng)元對外源性有害物質(zhì)和氧化損傷的敏感性，從而加重或促進損傷的發(fā)生[1，3]。嗅球（Olfactory bulb）是哺乳動物大腦的一部分，作為大腦中一個非常重要的感覺系統(tǒng)[4]，在許多疾病，特別是中樞神經(jīng)疾病初期就可發(fā)生神經(jīng)元損傷[4]。研究提示，嗅覺功能障礙的發(fā)生通常早于認知障礙[4-5]。但是，作為單獨的致病因素，HHcy所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷尚缺少組織學的證據(jù)；關(guān)于HHcy對嗅球神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和細胞凋亡的影響尚不清楚。本研究采用經(jīng)典的方法[1，2，6]，通過飼喂高蛋氨酸飲食，在ApoE-/-小鼠誘導HHcy，采用組織學，組織化學，免疫組織化學和原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）標記法（TUNEL）技術(shù)，對比觀察HHcy所致嗅球神經(jīng)元損傷及其細胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級近交系C57BL/6J背景5周齡雄性純合子ApoE-/-小鼠20只，體重為18～20 g（購自美國杰克遜實驗室），AIN-93G飼料（上海薩博生物有限公司），含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料（上海薩博生物有限公司）。 抗 神 經(jīng) 元 核 抗 原 （neuronal nuclei，NeuN） 抗體（Abcam 公司），HRP標記的兔二抗IgG（Invitrogen公司），TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（羅氏公司），DAB顯色試劑盒，PBS緩沖液等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理

ApoE-/-小鼠20只，適應性喂養(yǎng)1周。按照隨機化原則分為2組，每組10只：（1）正常飲食 ApoE-/-對照組（簡稱對照組），飼以普通AIN-93G飼料；（2） 高蛋氨酸飲食誘導高同型半胱氨酸血癥實驗組（簡稱實驗組），飼以添加1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料；所有動物均在相同條件下按分組的飲食喂養(yǎng)18周，室溫（22±1）℃，濕度 40%～70%，12 h 光照/12 h 黑暗，自由采食和飲水。

1.2.2 標本制備 高蛋氨酸飲食喂養(yǎng)18周，3.5%水合氯醛，0.1 ml/10 g麻醉小鼠，收集血液置于抗凝EP管，4℃冷藏。包括嗅球的腦組織沿矢狀切面一分為二，4%多聚甲醛固定。

1.2.3 血漿同型半胱氨酸水平測定 血液在室溫靜置30 min，離心（4℃，3 000 r/min）10 min后，分離上層血漿，裝入EP管。用ADVIA 2400全自動生化儀檢測血漿同型半胱氨酸濃度（μmol/L）。

1.2.4 尼氏染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水；亞甲藍10 min；分化液2 min；鉬酸銨溶液5 min，蒸餾水沖洗；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察，在高倍鏡（400X）下采圖，采用圖像分析軟件測定平均光密度值。

1.2.5 TUNEL 應用 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒檢測凋亡細胞，根據(jù)說明書進行實驗操作。在光學顯微鏡下觀察，高倍鏡下采圖，計數(shù)高倍鏡下TUNEL陽性的細胞數(shù)量，計算出每高倍鏡下TUNEL陽性細胞比例：TUNEL陽性細胞/TUNEL陽性細胞+TUNEL陰性細胞。

1.2.6 免疫組織化學染色 切片脫蠟水化，蒸餾水沖洗；高壓鍋抗原修復； 3%雙氧水室溫30 min，用PBS沖洗3次；山羊血清封閉，室溫30 min；NeuN一抗（1：200），濕盒4℃過夜；二抗37℃孵育1 h；用DAB顯色1 min； 蘇木素復染，中性樹脂膠封片。光學顯微鏡觀察，高倍鏡下采圖，采用圖像分析軟件計數(shù)高倍鏡下NeuN陽性的細胞數(shù)量，計算出每高倍鏡視野下NeuN陽性細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學處理。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行獨立樣本檢驗，計量資料數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標準差）表示，組間比較進行t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿同型半胱氨酸

對照組血漿總同型半胱氨酸為（6.47±2.66）μmol/L，實驗組為（23.71±6.30）μmol/L，實驗組血漿同型半胱氨酸含量明顯增加，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 血漿同型半胱氨酸測定結(jié)果

2.2 嗅球組織學

在對照組和實驗組，均可見基本的嗅球組織結(jié)構(gòu)，嗅神經(jīng)層，突觸球?qū)?，外叢狀層，僧帽細胞層，?nèi)叢狀層，顆粒細胞層清晰可見。與對照組比較，在實驗組未見明顯的細胞層次紊亂、腦水腫、壞死等結(jié)構(gòu)異?；虿±碜兓▓D2）。

2.3 Nissl體

通過尼氏染色可見，在顆粒細胞層、僧帽神經(jīng)元、嗅小球神經(jīng)元均可見比較豐富的Nissl體（圖3）。光密度值分析可見，實驗組Nissl體光密度值低于對照組（P＜0.05） （圖4）。

2.4 NeuN免疫組織化學

圖2 嗅球組織學

圖3 嗅球Nissl體染色結(jié)果

圖4 嗅球Nissl體染色光密度值統(tǒng)計結(jié)果

在對照組，僧帽神經(jīng)元、嗅小球神經(jīng)元、大多數(shù)顆粒層細胞NeuN陽性，陽性強度為棕黃色，著色強度基本一致，定位于細胞核。實驗組NeuN陽性情況與對照組接近，未見明顯的NeuN陽性細胞減少。對NeuN陽性顆粒細胞進行計數(shù)統(tǒng)計可見，實驗組NeuN陽性神經(jīng)元與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05） （圖 5）。

圖5 嗅球NeuN陽性細胞統(tǒng)計結(jié)果

2.5 細胞凋亡

在對照組，小鼠嗅球顆粒細胞層中散在少數(shù)TUNEL 陽性細胞，實驗組TUNEL陽性細胞明顯增加（圖6）。對TUNEL陽性顆粒細胞進行計數(shù)統(tǒng)計可見，實驗組TUNEL陽性顆粒細胞多于對照組（P＜0.05）（圖7）。

圖6 嗅球TUNEL染色結(jié)果

3 討論

圖7 嗅球TUNEL染色陽性細胞統(tǒng)計結(jié)果

嗅球是大多數(shù)哺乳動物（包括人類）中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在有害因素存在時，嗅球受到損傷的時間常常早于其他部分的腦組織[6]。有研究提示，嗅覺功能障礙可以作為早期診斷神經(jīng)變性疾病的重要指標，也是判斷其進展的重要依據(jù)[6-7]。流行病學和臨床研究提示，高同型半胱氨酸血癥（HHcy）與Alzheimer病，Parkinson病，腦萎縮以癲癇等有關(guān)[1，8]。本研究結(jié)果顯示，在高蛋氨酸食物飼喂的ApoE-/-小鼠，能夠引起中度HHcy，嗅球的組織學結(jié)構(gòu)存在，在光學顯微鏡下未見明顯的病理變化；從反映線粒體結(jié)構(gòu)的Nissl體可見，實驗組Nissl體染色光密度值明顯低于對照組；同時，實驗組TUNEL陽性細胞明顯增加。結(jié)果提示，HHcy能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)細胞線粒體損傷和凋亡增加。

目前，關(guān)于HHcy所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及其機制仍然不清楚。本研究結(jié)果顯示，HHcy組嗅球顆粒細胞TUNEL陽性細胞明顯增加。提示HHcy可能誘導小鼠嗅球神經(jīng)細胞的凋亡，從而影響嗅球神經(jīng)元的更新和功能。有研究提示，同型半胱氨酸可作為興奮性氨基酸，增加神經(jīng)元對外源性有害物質(zhì)損傷的敏感性[6-7]。HHcy能夠加重細胞對氧化損傷的敏感性，并誘發(fā)興奮性毒性[3，7]。研究提示，SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞系培養(yǎng)基加高同型半胱氨酸培養(yǎng)5天后，ROS產(chǎn)物增加4.4倍，隨著培養(yǎng)時間延長可產(chǎn)生基因毒性，引起DNA斷裂[3]。HHcy誘導的細胞損傷與谷氨酸受體亞型以及NMDA激活有關(guān)，也與DNA損傷、P53激活以及線粒體功能障礙有關(guān)[1，3，9]。

本研究通過高蛋氨酸飲食在ApoE-/-小鼠誘發(fā)了高同型半胱氨酸血癥。在實驗組，嗅球未見明顯的組織學異常；組織化學檢查可見，實驗組Nissl體染色光密度值明顯低于對照組；實驗組嗅球TUNEL陽性細胞明顯增加，原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導的脫氧尿苷三磷酸能夠標記出凋亡細胞。結(jié)果提示，高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е翧poE-/-小鼠嗅球神經(jīng)細胞線粒體損傷和凋亡增加，這可能與高同型半胱氨酸所致的神經(jīng)細胞損傷有關(guān)[10-11]。由于體內(nèi)同型半胱氨酸代謝復雜，其產(chǎn)生和排泄處于動態(tài)平衡過程中，高同型半胱氨酸誘導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損害具有十分復雜的過程和機制[6，12]。因此，要了解高同型半胱氨酸對神經(jīng)細胞的損傷及其機制尚需更多更深入的研究。

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Preliminary Study on the Injury of Olfactory Bulb Cells Induced by Hyperhomocysteinemia in Mice

ZHANG Jingwen1YAN Ru2CHANG Yue1QIN Jing3
1 School of Basic Medical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 2 Cardiac Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China; 3 Pathology Department, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan Ningxia 750004, China

ObjectiveTo investigate the characteristics of neuronal cell damage induced by hyperhomocysteinemia (HHcy).MethodsHyperhomocysteinemia was induce by a high-methionine diet in ApoE-/-mice. The histology, Nissl body and apoptosis in the olfactory bulb were comparatively studied by histology, histochemistry, immunohistochemistry and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling (TUNEL).ResultsThe total plasma homocysteine in the experimental HHcy group [(23.71±6.30) μmol/L] was significantly higher than that in the control group [(6.47±2.66) μmol/L ](P ＜ 0.05). In the control group and experimental HHcy group, the basic structure of olfactory bulb was observed, and there were no obvious histological abnormalities in the experimental HHcy group. Nissl body staining showed that the optical density of Nissl bodies in the experimental HHcy group was significantly lower than that in the control group (P ＜ 0.05). As was immunohistochemistry showed that no signi ficant difference between the numbers of NeuN-positive neuron between the experimental HHcy group and the control group (P ＞ 0.05). The numbers of TUNEL-positive granule cells in the experimental HHcy group were significantly higher than those in the control group (P ＜0.05).ConclusionThe hyperhomocysteinemia may be able to induce mitochondrial damage and apoptosis in olfactory bulb neurons of ApoE-/-mice.

olfactory bulb; apoptosis; Nissl body; mice; hyperhomocysteinemia

R589

A

1674-9316（2017）17-0127-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．17．068

寧夏醫(yī)科大學優(yōu)勢學科群研究項目（XY201714）

1寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院心臟中心，寧夏 銀川 750004；3 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院病理科，寧夏 銀川 750004