譯/劉海燕 校/顧佳升

（1 新希望乳業(yè)股份有限公司；2 上海奶業(yè)行業(yè)協(xié)會）

熱誘導(dǎo)牛奶中乳清蛋白與酪蛋白膠束反應(yīng)的機理研究

譯/劉海燕1校/顧佳升2

（1 新希望乳業(yè)股份有限公司；2 上海奶業(yè)行業(yè)協(xié)會）

將牛奶加熱到90 ℃，然后采用具體界定反應(yīng)的最終產(chǎn)物的方法來研究在熱誘導(dǎo)條件下，乳清蛋白和酪蛋白膠束之間的相互作用機理。在脫脂乳里添加了不同數(shù)量的乳清蛋白，加熱后分別查驗脫脂乳和依然懸浮分散在其中的酪蛋白膠束，由此獲得了牛奶在熱誘導(dǎo)條件下，“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互之間作用機制的確切信息。以α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與κ-酪蛋白的比率，以及在酪蛋白膠束顆粒中發(fā)現(xiàn)的α-乳白蛋白與β-乳球蛋白的比率，作為評估牛奶中發(fā)生熱誘導(dǎo)反應(yīng)程度的指標物。結(jié)果顯示，在低溫（70～90 ℃）間歇式加熱條件下，各種乳清蛋白相互作用，形成多類可溶性的復(fù)合物，在熱誘導(dǎo)過程中，擔任了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進一步與酪蛋白膠束發(fā)生反應(yīng)的中間體角色。對于乳清蛋白與酪蛋白膠束之間發(fā)生的任何交聯(lián)反應(yīng)而言，β-乳球蛋白的存在都是必需的；此外還發(fā)現(xiàn)，加熱后出現(xiàn)在酪蛋白膠束顆粒中β-乳球蛋白的數(shù)量，似乎受到酪蛋白膠束表面結(jié)合位點數(shù)量的限制，而這些結(jié)合位點的分布是離散的。

熱誘導(dǎo)牛奶；乳清蛋白；酪蛋白；機理

在熱處理過程中，牛奶發(fā)生著各種反應(yīng)，包括乳清蛋白的變性和聚集，以及乳清蛋白與酪蛋白膠束和脂肪球之間多種復(fù)合物的形成。關(guān)于α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）的變性現(xiàn)象，目前已經(jīng)通過多種模擬系統(tǒng)有了廣泛的研究。然而，即使理解了單個蛋白質(zhì)的變性機理，也只是對牛奶的熱處理期間所發(fā)生的復(fù)雜系列反應(yīng)的初始階段情況有初步的了解?；谶@個原因，目前需要一個不同的方法，旨在確定中間體的形成，以及環(huán)境條件的變化對它們的影響效果，即在加熱過程中“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”是如何相互作用的。

當全脂奶被加熱后，乳清蛋白不僅與酪蛋白膠束相互作用，而且與脂肪球相互作用。最近的研究已經(jīng)證明，雖然乳清蛋白與乳脂肪球結(jié)合的速度很快但數(shù)量較少，如果與結(jié)合于酪蛋白膠束上的數(shù)量相比較，在乳清蛋白和酪蛋白膠束之間形成的復(fù)合物，是迄今為止熱誘導(dǎo)反應(yīng)的重要的中間產(chǎn)物，并且存在于β-Lg（β-乳球蛋白）天然結(jié)構(gòu)中的游離巰基，似乎在相互作用過程中發(fā)揮了重要的作用。在牛奶熱處理過程中形成的主要復(fù)合物是“β-Lg/κ-酪蛋白復(fù)合物”。研究發(fā)現(xiàn)，不僅β-Lg，α-La也參與了與酪蛋白膠束的反應(yīng)。已有報道，當存在β-Lg時，α-La的變性程度會增加。也有報道指出，α-La的自身變性其實是半可逆的。

盡管對牛奶的熱處理已經(jīng)有了廣泛的研究，但是目前關(guān)于在熱誘導(dǎo)下，α-La和β-Lg與酪蛋白膠束之間的相互作用機制細節(jié)并不清楚。本文描述了在牛奶溫度高達90℃的加熱過程中，就添加乳清蛋白到脫脂乳中的效果，以及對依然懸浮分散的酪蛋白膠束的影響，探討α-La、β-Lg和酪蛋白膠束顆粒之間的相互作用問題。

1 試驗設(shè)計

從圭爾夫大學的Elora研究站收集新鮮的全脂牛奶。在加入0.2 g/L的疊氮化鈉作為防腐劑后，通過低速離心（3 000 g，20 min）將牛奶脫脂。再通過離子交換層析制備單個α-La和β-Lg，用4 L 20 mmol/L的Tris pH值緩沖液（0～1 M NaCl梯度）洗脫。透析后，將分離的蛋白質(zhì)凍干并在加熱前以干粉形式加入到脫脂乳中。在熱處理之前，將純化的α-La和β-Lg加入到脫脂乳中，在改變了原奶蛋白質(zhì)濃度的情況下，研究α-La、β-Lg和酪蛋白膠束之間的熱誘導(dǎo)復(fù)合物的組成所產(chǎn)生的影響。此外，還采用超濾牛奶的方法處理懸浮的酪蛋白膠束。將未處理過的脫脂乳用60 000 g離心40 min的方法，獲得凈化的酪蛋白膠束。使用10 000 Da截留膜的實驗室超濾裝置制備超濾液。在熱處理之前加入并分散了不同數(shù)量的純化α-La和β-Lg。

將樣品在溫控水?。?0～90℃）的試管中加熱不同時間。熱處理后，樣品在冰浴中快速冷卻。

采用超速離心方法，從熱處理過的樣品中分離獲得在熱誘導(dǎo)下乳清蛋白和酪蛋白膠束之間相互作用所形成的最終復(fù)合物，采用Corredig和Dalgleish在1996年所述的SDS-PAGE電泳法進行分析，根據(jù)α-La和β-Lg與κ-酪蛋白相結(jié)合比率進行定量，將這些比率關(guān)系作為乳清蛋白和酪蛋白之間的反應(yīng)指數(shù)。此外，有報道建議使用α-La/β-Lg作為一種評估脫脂乳經(jīng)受熱處理強度的方法，用以研究α-La / β-Lg與乳中蛋白質(zhì)濃度比率的變化規(guī)律。

2 結(jié)果和討論

當牛奶經(jīng)過75～90 ℃的間歇加熱處理時，乳清蛋白與酪蛋白膠束的相互作用程度隨時間和溫度的增加而加劇。通常與膠束顆粒相結(jié)合的乳清蛋白數(shù)量，隨著加熱時間的延長而增加至最大值，并且溫度越高，蛋白質(zhì)之間的相互作用越快。早前的研究表明，環(huán)境條件的變化強烈影響α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的熱誘導(dǎo)相互作用。方差分析顯示，不僅加熱的時間和溫度，而且脫脂乳中存在的乳清蛋白數(shù)量，都將顯著影響與酪蛋白膠束相結(jié)合的α-La/κ-酪蛋白和β-Lg/ κ-酪蛋白的數(shù)量。

熱處理后觀察到的α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合情況，與Law等在1994年研究結(jié)果相一致。圖1為加熱溫度為80 ℃，保持不同時間的脫脂乳，與酪蛋白結(jié)合的重量比率變化情況，采用4 次獨立試驗結(jié)果的平均值，計算黑塊、左坐標為α-La/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓、右坐標為β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率。結(jié)果顯示，在低于90 ℃的加熱過程中，蛋白質(zhì)不僅與膠束相互作用，而且具有非常相似的動力學行為（圖1）。

溫度（90 ℃）似乎在反應(yīng)機制中是一個關(guān)鍵臨界值，與表達乳清蛋白變性動力學的阿倫尼烏斯圖斜率變化一致。當牛奶在低溫下加熱時，兩種乳清蛋白質(zhì)的變化情況表現(xiàn)相似，其在酪蛋白膠束顆粒中的數(shù)量，與它們在原奶中的濃度直接相關(guān)。圖2為加熱溫度為80 ℃的脫脂乳，隨著保持時間的增加，與酪蛋白結(jié)合的乳清蛋白/κ-酪蛋白的重量比率也在變化，黑塊所示2 g/L β-Lg脫脂乳中β-Lg/κ-酪蛋白的重量比率，黑圓所示2 g/L α-La脫脂乳中α-La/κ-酪蛋白的重量比率。顯示結(jié)果也證實了上述假設(shè)。

圖1 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨著保持時間的變化與酪蛋白結(jié)合的重量比率變化情況

圖2 加熱溫度為80 ℃的脫脂乳隨保持時間的變化，與酪蛋白結(jié)合的乳清蛋白/κ-酪蛋白比率的變化情況

當添加2 g/L α-La中時，α-La和β-Lg的濃度相當，具有相同的相互作用動力學，處理后與膠束顆粒相結(jié)合的數(shù)量也相似。加入2 g/L β-Lg的脫脂乳在80 ℃加熱（圖2），幾分鐘后即達到β-Lg /κ-酪蛋白的最大值。而β-Lg /κ-酪蛋白所達到的高數(shù)值，與對照奶樣品所達到的穩(wěn)定值并沒有顯著的不同。該結(jié)果表明，在酪蛋白膠束顆粒的表面上只有一定數(shù)量的位點可以用于與β-乳球蛋白發(fā)生相互作用。α-La的作用行為不同于β-Lg，在相同條件下加熱后，α-La即可以增加與酪蛋白膠束顆粒相結(jié)合的數(shù)量。

加熱后膠束顆粒中兩種乳清蛋白的存在及其在低溫（直到90℃）下加熱時的類似動力學行為表明，乳清蛋白內(nèi)部可能形成了可溶性的聚合物，即兩種乳清蛋白——α-La和β-Lg，彼此反應(yīng)，形成中間體復(fù)合物，再與酪蛋白膠束發(fā)生相互作用?，F(xiàn)已知在低溫下，β-Lg需要時間改變結(jié)構(gòu)，可能是α-La參與酪蛋白膠束反應(yīng)的原因。在加熱下依然懸浮分散的酪蛋白膠束，添加不同數(shù)量的α-La和β-Lg，結(jié)果表明盡管α-La的存在并不影響β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合作用，但β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合需要 α-La。

圖3顯示80 ℃加熱后在酪蛋白膠束顆粒中α-La/β-Lg的比率，與脫脂乳中α-La和β-Lg濃度的函數(shù)關(guān)系。添加不同數(shù)量乳清蛋白的脫脂乳，在同為80 ℃但不同保持時間條件下，與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La/β-Lg的比率，三者之間的函數(shù)關(guān)系，其中黑圓為對照樣脫脂乳，黑塊為添加2 g/L α-La的脫脂乳，白圓為添加2 g/L β-Lg的脫脂乳，白塊為各添加1 g/L α-La和β-Lg的脫脂乳。

對沒有添加蛋白質(zhì)的脫脂乳進行的加熱試驗中，α-La/ β-Lg的比率反映了它們的原始組成。當添加2 g/L α-La時，兩種乳清蛋白具有相似的濃度，與酪蛋白膠束相結(jié)合的α-La/ β-Lg的比率高于對照樣品中的比率，并且達到約0.8 mg α-La/ mg β-Lg。當1 g/L α-La和1 g/ L β-Lg同時添加到脫脂乳中時，α-La/β-Lg的比率雖然與對照樣品相比是明顯不同的，然而向脫脂乳中加入更多的α-La時，再也沒有顯著的效果差異了（圖3）。該結(jié)果證實了如下假設(shè)，即只存在數(shù)量有限的離散分布的結(jié)合位點可用于β-Lg與酪蛋白膠束的相互結(jié)合。此外，額外添加β-Lg到脫脂乳中，如果與對照樣品比較，并不能有意義地改變與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La和β-Lg的比率。筆者對依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束，再加入不同量的乳清蛋白進行了多次研究，得到了上述結(jié)論。

圖3 不同數(shù)量乳清蛋白脫脂乳，在不同保持時間下，與酪蛋白膠束結(jié)合的α-La/β-Lg比率之間的函數(shù)關(guān)系

總之，在加熱（低溫間歇加熱）條件下，認識到了兩種主要的相互作用：一是β-Lg與酪蛋白膠束通過κ-酪蛋白結(jié)合的直接相互作用；二是α-La和β-Lg與酪蛋白膠束的結(jié)合，是通過在溶液中這兩種乳清蛋白之間的反應(yīng)所形成的中間體來實現(xiàn)的。對脫脂乳和依然呈懸浮狀分散的酪蛋白膠束兩種物料所進行的熱處理試驗，都表明了能夠與酪蛋白膠束相互結(jié)合的β-Lg數(shù)量，受可用的結(jié)合位點數(shù)量的限制。能夠與酪蛋白膠束顆粒相結(jié)合的α-La的數(shù)量，似乎只取決于其在奶中的濃度。C

英文原文：Corredig M，Dalgleis D G. The mechanisms of the heat-induced interaction of whey proteins with casein micelles in milk[J]. International Dairy Journal，1999，9 （3–6）：233-236.

2017-06-19）

劉海燕，博士，高級工程師，從事乳制品生產(chǎn)管理、質(zhì)量控制、乳品技術(shù)研究工作。

校者簡介：

顧佳升（1948-），男，學士，高級工程師，研究方向為乳品加工及檢驗。