姚 暢 程 珂 趙 玲 沈雪勇

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 浙江 杭州 310005 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 上海 201203

艾灸對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型血清IL-1β、COX-2、COMP表達(dá)的影響

姚 暢1程 珂2趙 玲2沈雪勇2

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 浙江 杭州 310005 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 上海 201203

艾灸 膝骨關(guān)節(jié)炎 IL-1β COX-2 COMP 兔

膝骨性關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的中老年疾病，膝關(guān)節(jié)的疼痛和功能障礙嚴(yán)重影響了患者的生活。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療進(jìn)行了大量臨床研究，報(bào)道的治療手段包括休息、物理治療、藥物治療、支具、運(yùn)動(dòng)療法和手術(shù)等。目前臨床常用非類(lèi)固醇消炎止痛藥（NSAID），通過(guò)這類(lèi)藥物抗炎、止痛和解熱作用來(lái)進(jìn)行治療。但是西藥有較大的副作用，長(zhǎng)期服用也會(huì)對(duì)患者的胃腸功能造成影響。膝骨性關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)屬“痹證”范疇，其病機(jī)以肝腎虧虛為本，感受風(fēng)、寒、濕外邪，氣血瘀滯為標(biāo)。中醫(yī)艾灸可溫通經(jīng)絡(luò)，驅(qū)散寒邪，行氣活血，消瘀散結(jié)，在治療膝骨性關(guān)節(jié)炎方面有其獨(dú)特的療效和優(yōu)勢(shì)。IL-1β、COX-2、COMP在膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理過(guò)程中均起到了重要作用。IL-1β作為一種致炎細(xì)胞因子，在炎性疼痛中主要介導(dǎo)炎性痛敏。COX-2在正常組織細(xì)胞內(nèi)的活性極低，當(dāng)受到誘導(dǎo)后大量產(chǎn)生，它通過(guò)對(duì)前列腺素（PG）合成的促進(jìn)作用，介導(dǎo)炎癥和疼痛等反應(yīng)。C

OMP是軟骨中非膠原蛋白的主要成分,作為一種軟骨代謝標(biāo)記物，軟骨的損傷、修復(fù)和代謝變化均可能影響COMP的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究艾灸對(duì)兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型血清中IL-1β、COX-2、COMP表達(dá)的影響，探討艾灸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康新西蘭大耳白兔22只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg,由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[SCXK（滬）2009-0069]，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2009-0018]。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑：紙管貼穴灸(泰州市灸療研究所提供)；主要試劑：采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)IL-1β、COX-2、COMP，試劑盒（上海活樂(lè)生物科技有限公司提供），3℅戊比妥鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司提供，批號(hào)：F20020915），慶大霉素（上海哈靈生物科技有限公司提供，批號(hào)：HL130326），95%酒精（上海哈靈生物科技有限公司提供，批號(hào)：B1227012）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀：芬蘭（Labsystems Mul tiskan MS），型號(hào)：352型，洗板機(jī)：芬蘭（Thermo Labsystems），型號(hào)：AC8，離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)），型號(hào)：TG16W，培養(yǎng)箱：隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)），型號(hào)：GNP-9080型。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.4.1 動(dòng)物造模及分組：將22只健康白兔隨機(jī)分組，正常對(duì)照組6只，艾灸組和模型組均8只。其中正常對(duì)照組不做任何造模處理。艾灸組、模型組均采用Hul th骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型法[1]造模。將兔用3℅戊比妥鈉(30mg/ kg)靜脈麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)。右膝關(guān)節(jié)局部脫毛、備皮、消毒、鋪洞巾，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，并剪斷2-3mm,從髕韌帶內(nèi)側(cè)切口進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，止血、沖洗關(guān)節(jié)腔,抽屜實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性后表明前交叉韌帶已離斷，逐層縫合。術(shù)后傷肢不予固定，置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠中自由活動(dòng)及進(jìn)食,手術(shù)后每只肌注慶大霉素0.5ml[2]，每日1次，連續(xù)3天。術(shù)后1周傷口愈合，驅(qū)趕兔每天活動(dòng)30分鐘，6周后可獲得OA模型。

1.4.2 干預(yù)方法：造模成功后開(kāi)始進(jìn)行分組處理：艾灸組將兔置于固定器中，右側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)局部剪毛，將紙管貼穴灸黏貼于兔犢鼻穴，點(diǎn)燃施灸，燃盡后再黏再灸。施灸過(guò)程中觀察兔的反應(yīng)，防止其活動(dòng)而艾炷脫落。每次2壯，隔日1次，每周3次，連續(xù)治療4周。模型組將兔置于固定器中，右側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)局部剪毛，將紙管貼穴灸黏貼于兔犢鼻穴，不點(diǎn)燃，20分鐘后取下。隔日1次，每周3次，連續(xù)治療4周。正常對(duì)照組不造模，不治療。單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食。

1.4.3 標(biāo)本采集：4周后抽取三組兔耳緣靜脈血5ml，將采到的血液放在離心管里，盡量避免晃動(dòng)，不要蓋緊以防溶血，在室溫下靜置2小時(shí)，3500轉(zhuǎn)離心10分鐘后取血清，分裝試管后置于-80℃冰箱中冷藏待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清中IL-1β、COX-2、COMP的含量。ELISA法即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)，該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便及易于自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。參照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū),以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以Mean±SD表示，組間兩兩比較采用one-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP表達(dá)結(jié)果比較:與正常對(duì)照組相比，模型組和艾灸組的血清IL-1β、COX-2、COMP含量均增高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組血清IL-1β、COX-2和COMP含量均降低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表達(dá)（±s）

表1 各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表達(dá)（±s）

注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達(dá)英-35組SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例數(shù)9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、骨質(zhì)增生為主要病變特點(diǎn)的退行性疾病，其病因非常復(fù)雜，可能與化學(xué)、生物、機(jī)械以及酶反應(yīng)通路等因素有關(guān)。IL-1β、COX-2、COMP在其病理過(guò)程中均起到了重要作用。IL-1β大量存在于在OA軟骨組織中、上層軟骨細(xì)胞及基質(zhì)中，可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）合成，并激活MMPs，同時(shí)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的合成,使膠原蛋白的降解增加,通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡,抑制軟骨基質(zhì)合成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞[3-4]。IL-1β通過(guò)磷酸化JNK來(lái)激活c-Jun/AP-1、降低Sox9的水平(蛋白質(zhì)或mRNA)，從而抑制透明軟骨特征性Ⅱ、Ⅳ型膠原的合成，促進(jìn)具有纖維母細(xì)胞特性的Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞變性，抑制軟骨細(xì)胞增殖和蛋白多糖的合成。另外，IL-1β還可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌PGE2參與關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)，刺激骨吸收及成骨細(xì)胞樣細(xì)胞增殖,導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨、軟骨增生性變化。

COX-2是炎癥過(guò)程中一個(gè)重要的誘導(dǎo)酶，在生理狀態(tài)呈現(xiàn)低表達(dá)[5]，一旦受到細(xì)菌脂多糖(LPS)、炎癥細(xì)胞因子等刺激時(shí)，會(huì)主要在軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá)。COX-2促進(jìn)軟骨細(xì)胞將花生四烯酸轉(zhuǎn)化成PGE2，軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌PGE2和膠原酶增加，加速軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的分解，并抑制其合成，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨免疫反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨組織造成破壞[6]。

膝骨性關(guān)節(jié)炎可歸于中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”“筋痹”等范疇，本病與年老體衰、長(zhǎng)期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)。《素問(wèn)·痹論篇第四十三》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！薄毒霸廊珪?shū)》云：“蓋痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也?！睆?qiáng)調(diào)了膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中寒凝、血瘀、氣滯的病機(jī)。灸法是以艾為主要施灸材料，點(diǎn)燃后在體表穴位或病變部位燒灼、溫熨，借其溫?zé)帷⑺幬锏拇碳ぷ饔?，以治療疾病的一種方法。灸法是針灸療法的一個(gè)重要組成部分?！鹅`樞·官能》明確指出“針?biāo)粸?，灸之所宜”?！夺t(yī)學(xué)入門(mén)》說(shuō)：“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之”。艾灸能溫通經(jīng)絡(luò)、散寒逐痹，使“不通則痛”為“通則不痛”，故臨床上常以艾灸來(lái)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎，并顯現(xiàn)出較理想的療效。艾灸作為中醫(yī)外治法之一，具有溫經(jīng)通絡(luò)，活血消瘀，通痹散結(jié)之功效，能有效地改變血液的高濃、高聚、高黏狀態(tài)[7]。艾灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的療效已得到了大量臨床研究的證實(shí)[8],本實(shí)驗(yàn)是對(duì)其治療機(jī)制機(jī)理的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和艾灸組的血清IL-1β、COX-2、COMP的含量均要增高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組相比，艾灸組血清IL-1β、COX-2和COMP的含量均要降低，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明艾灸可降低血清IL-1β、COX-2和COMP含量，從而減輕炎癥反應(yīng)，緩解疼痛，減少關(guān)節(jié)軟骨的損傷，達(dá)到一定的治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的效果。今后將考慮擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究艾灸治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

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2017-05-21