姚侃男 馮彩珠 朱肖鴻

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310018

中藥研究

枳椇子對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子表達的影響

姚侃男1馮彩珠1朱肖鴻2#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310018

枳椇子 RAW264.7巨噬細胞 脂多糖 TLR4

實驗組在先期研究中已得到枳椇子可以減輕酒精灌胃大鼠炎癥及脂肪變[1]。本文在先期研究基礎(chǔ)上，探索枳椇子對LPS作用于RAW264.7巨噬細胞所產(chǎn)生的細胞因子的影響及其相關(guān)機制，明確枳椇子對腸源性內(nèi)毒素血癥的保護作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑：枳椇子顆粒劑購自江陰天江藥業(yè)有限公司；LPS購自Sigma公司；RAW264.7；30%丙烯酰胺（29:1）、RIPA組織細胞快速裂解液、過硫酸銨、SDS、Tris購自Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒購自Thermo公司；蛋白預(yù)染Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；Rabbit anti TLR4 Polyclonal antibody（96kD）、Rabbit anti p65（65kD）購自Proteintech公司；p-p65（65kD）購自Aff inity公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）（37kD）購自CST公司；羊抗兔HRP標記二抗、驢抗山羊HRP標記二抗、羊抗鼠HRP標記二抗購自碧云天公司；NC膜、發(fā)光液購自Mi l lipore公司；PBS磷酸鹽緩沖液購自上海長島抗體診斷試劑公司；脫脂奶粉購自BD分裝公司；Tween-20購自Amresco公司；Trizol購自Invit rogen公司；DEPC處理水購自基爾頓生物；異丙醇、無水乙醇、氯仿購自國藥集團。

1.2 主要儀器：TG-16M型低溫冷凍離心機購自上海盧湘離心機儀器有限公司；K30型渦旋振蕩器購自青浦瀘西儀器廠；ABI-7300型Real-time檢測儀購自ABI公司；PRO200型電動勻漿儀購自FLUKO公司；mini protean 3 cel l型電泳儀購自BIO-RAD公司；PS-9型電轉(zhuǎn)儀購自大連競邁科技有限公司；MK3型酶標儀購自芬蘭雷勃酶標儀；P型移液器購自吉爾森公司；HI1210型水浴鍋購自Leica公司；Tanon-520型成像系統(tǒng)購自Tanon公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)：RAW264.7用含10%胎牛血清，1%雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞用于實驗。

2.2 Western Blot法檢測RAW264.7巨噬細胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量：將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計數(shù)，按照每孔50萬的密度鋪入6孔板中，每組細胞每塊板接種3個同樣的孔作為復(fù)孔。每塊板設(shè)置4個組，處理24h后，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測各組細胞蛋白濃度，PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，膜上蛋白檢測，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1h，ECL顯色。根據(jù)先期試驗結(jié)果，枳椇子濃度取0.8mg/ml。分組見表1。2.3 qRT-PCR法檢測RAW264.7巨噬細胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-βmRNA的表達：采用Trizol試劑提取總RNA，操作流程按試劑盒進行。根據(jù)基因序列設(shè)計PCR引物，具體見表2。合成cDNA第一條鏈，取2μLcDNA為模板，在25μL反應(yīng)體系中進行r tPCR擴增，反應(yīng)條件：95℃變性15s，60℃退火45s，循環(huán)40次。據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Sof tware。

表1 細胞分組

3 結(jié)果

3.1 枳椇子提取液對RAW264.7細胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影響：由圖1及圖2可知，相比空白對照組，LPS未處理時，枳椇子對TLR4、p-p65、p65蛋白含量無顯著影響；而LPS處理后，單純的LPS處理組TLR4、pp65含量增加，p65蛋白含量無顯著變化；與單純的LPS處理組相比，枳椇子處理組的TLR4、p-p65蛋白含量減少，p65蛋白含量無顯著變化。

表2 引物序列

圖1 Western blot檢測TLR4、p-p65、p65條帶圖譜

圖2 枳椇子提取液對巨噬細胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影響

3.2 枳椇子提取液對RAW264.7細胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達的影響：由圖3可知，相比空白對照組，LPS未處理時，枳椇子對TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達無顯著影響；而LPS處理后，單純的LPS處理組上調(diào)TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達，下調(diào)IL-10mRNA表達；與單純的LPS處理組相比，枳椇子處理組的TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達顯著下調(diào)，上調(diào)IL-10mRNA表達。

圖3 枳椇子對巨噬細胞組中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達的影響

4 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞增加TLR4、p-p65蛋白表達，上調(diào)促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達，抑炎因子IL-10的含量減少；枳椇子在0.8mg/ml時則可減少TLR4、p-p65含量及抑炎因子如TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達顯著下調(diào)，上調(diào)IL-10mRNA表達，其機制可能與枳椇子能調(diào)節(jié)抑炎因子與促炎因子的失衡狀態(tài)相關(guān)。我們也可從中得出，枳椇子可調(diào)節(jié)肝內(nèi)免疫，同時對改善肝臟炎癥有明顯確切的療效。此后，我們也將進一步進行枳椇子相關(guān)的動物實驗研究，為臨床使用枳椇子治療酒精相關(guān)性肝病提供依據(jù)。

[1]陳春曉,朱肖鴻.酒精性肝炎大鼠模型建立及枳椇子的干預(yù)作用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,17（5）：285-287.

2017-04-10

# 通訊作者：朱肖鴻，E-mai l：zxh922@sina.com