劉彬彬 姚嘉明 葉 蔚 王晶磊 楊一天 王小奇

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

實(shí)驗(yàn)研究

俞氏清熱活血法灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究*

劉彬彬1姚嘉明1葉 蔚1王晶磊2楊一天2王小奇1

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

俞氏清熱活血法 灌腸療法 潰瘍性結(jié)腸炎 實(shí)驗(yàn)研究

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是炎癥性腸?。↖BD）的一種常見類型，臨床上以反復(fù)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重為主要表現(xiàn)。其主要病理學(xué)改變?yōu)槔奂爸蹦c、結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎癥。該病是一種自身免疫性疾病，遷延不愈，病程可長達(dá)數(shù)十年，亦有發(fā)生癌變的可能性。但因發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)仍缺乏特效治愈方法，所用藥物亦有較多不良反應(yīng)，部分患者難以耐受。UC屬中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”“下利”“久痢”“休息痢”等范疇，中醫(yī)藥對(duì)于上述疾病常具有獨(dú)到的療效，患者一般較易接受。著名老中醫(yī)俞尚德先生從醫(yī)七十余年，專攻消化系疾病，其善用清熱活血法灌腸治療該病，頗有良效。本研究采用俞氏清熱活血法中藥灌腸治療三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸制作的大鼠UC模型，通過觀察大鼠體重變化、結(jié)腸黏膜大體形態(tài)及組織學(xué)損傷情況、血白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平來明確該法的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠60只，雄性，清潔級(jí)，體重160-190g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度保持在18～22℃，濕度保持在45%～65%。

1.2 大鼠模型的建立：所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食不禁水24小時(shí)后予麻醉，用直徑2mm、長約12cm的硅膠軟管自大鼠肛門插入腸腔內(nèi)，深度約8cm，將30mgTNBS (0.6ml，由美國SIGMA公司提供)的50%乙醇(0.25ml)溶液0.85ml快速注入（正常組以同體積蒸餾水代替），并捏緊肛門，提取大鼠尾巴倒置5分鐘，待其麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

1.3 藥物的配制：按處方（黃芩、丹參、蒲公英、紅藤、敗醬草各30g，半邊蓮、半枝蓮、薏苡仁各20g）比例取定量的藥材（由杭州市中醫(yī)院中藥房提供），根據(jù)成人與大鼠的等效劑量折算成20g/kg·d為低劑量組，40g/kg·d為中劑量組，80g/kg·d為高劑量組，每劑制備濃煎液2ml。美莎拉嗪（由法國愛的發(fā)制藥公司提供）研磨，根據(jù)成人與大鼠的等效劑量折算成0.3g/kg·d配置混懸液。

1.4 分組及處理：60只SD大鼠隨機(jī)分成6組，正常組、模型組、美莎拉嗪組及高、中、低劑量組各10只。造模前稱重，造模后次日起各組開始灌腸給藥，每日1次，連續(xù)10天。正常組和模型組每組每只均以蒸餾水2ml灌腸；高、中、低劑量組分別給予復(fù)方中藥藥汁2ml灌腸；美莎拉嗪組予美莎拉嗪混懸液2ml灌腸。所有大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)及自由飲水。各組大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行稱重，取血，用直接心腔取血法，失敗者立即改用腹腔動(dòng)脈取血法，注入試管送檢血常規(guī)，然后全部處死，迅速剖取結(jié)腸，自肛門以上2cm處向上取結(jié)腸6～8cm，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，用生理鹽水沖洗干凈，并將腸黏膜向上平鋪于蠟板上，大頭釘固定后，用放大鏡對(duì)結(jié)腸進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)損傷評(píng)分，剪取病變最明顯的結(jié)腸標(biāo)本（2cm左右），用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，并取部分切片行HE染色。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)：觀察各組大鼠各組大鼠造模及藥物干預(yù)前后體重的變化；用放大鏡對(duì)結(jié)腸黏膜進(jìn)行大體形態(tài)損傷評(píng)分；光鏡下觀察結(jié)腸黏膜組織學(xué)改變并進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分；血常規(guī)檢測(cè)大鼠血細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況：灌腸24小時(shí)后，大鼠開始出現(xiàn)動(dòng)作遲緩，進(jìn)食量明顯減少，并開始腹瀉，為黃色稀便及血便，污染肛門周圍被毛，癥狀一直持續(xù)。復(fù)方低、中、高劑量組各有1只大鼠因灌腸時(shí)操作不當(dāng)出現(xiàn)腸穿孔致死，模型組及復(fù)方不同劑量組另有5只大鼠在灌腸后1～7日內(nèi)死亡，剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡大鼠結(jié)腸腸壁厚度明顯增加，腸黏膜嚴(yán)重充血、水腫、糜爛及存在不同程度潰瘍，且均出現(xiàn)了結(jié)腸粘連及擴(kuò)張，考慮死亡原因可能為腸梗阻。

2.2 各組大鼠體重變化：見表1。

表1 各組大鼠體重的下降比例(±s)

表1 各組大鼠體重的下降比例(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.05。

分組正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組美沙拉嗪組例數(shù)10體重下降比例（%）-5.62±18.15 10.51± 2.14 4.93± 1.53 2.36± 1.23*2.40± 0.91*2.63± 9.20*9 7 8 8 1 0

2.3 各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分：除正常組外，各組大鼠存在結(jié)腸充血、厚度增加、腸黏膜充血、水腫、糜爛出血、潰瘍等。參照Wal lace和keenan的標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行大體形態(tài)損傷評(píng)分，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸粘膜形態(tài)及組織學(xué)損傷評(píng)分（±s）

表2 各組大鼠結(jié)腸粘膜形態(tài)及組織學(xué)損傷評(píng)分（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

分組正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組美沙拉嗪組HE染色組織學(xué)損傷評(píng)分0 8.89±1.83 6.86±1.57*6.63±1.30**5.50±2.56**6.10±3.28*例數(shù)10 9 7 8 8 1 0大體形態(tài)損傷評(píng)分0 7.00±1.66 6.14±1.57 5.13±1.46*5.13±1.36*5.10±2.03*

2.4 光鏡下各組大鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)改變及損傷評(píng)分：HE染色后光鏡下觀察，見模型組大鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)明顯糜爛,腸壁壞死已深達(dá)肌層，炎細(xì)性胞浸潤腸壁全層, 黏膜及腺體發(fā)生脫落并形成潰瘍?cè)?腸壁水腫增厚明顯，并存在纖維化表現(xiàn)；各藥物干預(yù)組亦存在上述表現(xiàn)，但部分損傷程度較模型組略輕。參照Dieleman LA等[2]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)損傷評(píng)分，結(jié)果見表2。

2.5 各組大鼠血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平：見表3。

表3 各組大鼠血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平（±s）

表3 各組大鼠血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與正常組比較，ΔΔP＜0.01。

中性粒細(xì)胞(×109/L) 1.31±0.82 5.79±1.89ΔΔ4.37±1.06**ΔΔ3.11±1.28**ΔΔ2.21±0.83**2.90±0.99**ΔΔ分組正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組美沙拉嗪組例數(shù)10 9 7 8 8 1 0白細(xì)胞(×109/L) 6.19±1.75 23.26±2.88ΔΔ18.48±2.41**ΔΔ14.03±3.08**ΔΔ12.92±2.58**ΔΔ13.69±0.63**ΔΔ

3 討論

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療仍缺乏特效藥物，主要以氨基水楊酸、類固醇激素、免疫抑制劑三大類藥物治療為主。而中醫(yī)藥在治療上顯示其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)，臨床上應(yīng)用廣泛，且常能獲得較好的療效，患者的耐受度較好。但許多中醫(yī)藥療法尚停留于經(jīng)驗(yàn)性治療階段，缺乏對(duì)其療效及作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)及臨床研究，對(duì)擴(kuò)大應(yīng)用造成了諸多影響。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，UC的產(chǎn)生多因稟賦不足、感受外邪、內(nèi)傷飲食及情志、病后體虛所致，以上病因單獨(dú)致病，亦可合而為病?，F(xiàn)代許多醫(yī)家均認(rèn)為該病的發(fā)病機(jī)制主要是脾虛導(dǎo)致中焦失于健運(yùn)，小腸無以分清泌濁，大腸傳導(dǎo)失司，濕熱蘊(yùn)結(jié)，氣血凝滯，腸絡(luò)失和，血敗肉腐，而成本病[3]。俞老認(rèn)為，濕熱蘊(yùn)腸、氣滯絡(luò)瘀為該病之基本病機(jī)，脾虛失健為主要發(fā)病基礎(chǔ)，疾病活動(dòng)期以標(biāo)實(shí)為主，主要為濕熱蘊(yùn)腸，氣血不調(diào)；緩解期屬本虛標(biāo)實(shí)，主要為正虛邪戀，運(yùn)化失健，且本虛多呈脾虛，亦有兼腎虧者。針對(duì)活動(dòng)期UC的治療，俞老以清熱活血法之經(jīng)驗(yàn)方灌腸治療常取得良效。該方以清熱解毒，健脾活血為治則，黃芩、半邊蓮、半枝蓮、丹參、薏苡仁等組方，共奏清熱解毒，活血化瘀，健脾化濕、消腫生肌之功。為進(jìn)一步充分驗(yàn)證該治療方法的療效，本研究選用三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸制作UC大鼠模型，并對(duì)其進(jìn)行藥物干預(yù)。該模型符合UC腸道炎癥發(fā)作期的特點(diǎn)，目前被公認(rèn)較適合進(jìn)行藥物療效評(píng)價(jià)[4]。造模后，模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的腹瀉、便血癥狀，體重停止增長并出現(xiàn)明顯下降，結(jié)腸黏膜通過肉眼及光鏡下觀察均出現(xiàn)了明顯的急性炎癥表現(xiàn)，血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞明顯升高，非常類似于人潰瘍性結(jié)腸炎急性發(fā)作期的疾病特點(diǎn)，說明造模成功。造模后筆者進(jìn)行了藥物灌腸干預(yù)，結(jié)果顯示，復(fù)方中、高劑量組在大鼠體重減輕比例、結(jié)腸黏膜大體形態(tài)及組織學(xué)損傷評(píng)分、血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平這幾方面均較模型組有明顯降低，說明俞氏清熱活血法灌腸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠具有明顯的治療作用，且療效與美沙拉嗪相當(dāng)。

[1]Wal lace JL,Keenan CM.An oral ly active inhibitor of leukot riene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis[J].Am J Physiol，1990，258(4 Pt 1)：527-534.

[2]Dieleman LA,Palmen MJ,Akol H,et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS)is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J]. Cl in Exp Immunol，1998，114(3)：385-391.

[3]任青偉，陳軍賢.中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究現(xiàn)狀.浙江中醫(yī)雜志,2016,51(10)：773-774.

[4]鄭文瀟,吳翔.潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志，2016，11(9)：861-864，867.

2017-03-17

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目俞氏清熱活血法灌腸治療對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠β-ar restin1/2相關(guān)信號(hào)通路的影響，編號(hào)：2013B16