吳雄健++鄭虹+朱海燕+毛忠懿+張蕾++謝軍

[摘要]目的 探討骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植后肝星狀細(xì)胞凋亡情況及其治療肝纖維化的機(jī)制。方法 購(gòu)買(mǎi)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的30只清潔級(jí)SD大鼠，實(shí)驗(yàn)研究選取20只，將提取骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的10只作為實(shí)驗(yàn)組，建立肝纖維化大鼠模型，骨髓干細(xì)胞動(dòng)員干預(yù)大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞凋亡，檢測(cè)肝纖維化及星狀細(xì)胞凋亡指標(biāo)；將未提取骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的10只作為對(duì)照組，不對(duì)其進(jìn)行干預(yù)。然后對(duì)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的純度鑒定結(jié)果進(jìn)行分析，并對(duì)兩組大鼠的肝臟羥脯氨酸含量、肝星狀細(xì)胞激活及凋亡情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 CD34、CD44、CD45、CD95陰性細(xì)胞分別為99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。實(shí)驗(yàn)組大鼠CCl4皮下注射誘導(dǎo)8周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05），對(duì)照組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝星狀凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前及對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植后誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡可能是其治療肝纖維化的一個(gè)主要機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植；肝星狀細(xì)胞；凋亡情況；肝纖維化；治療機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R575.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）07（c）-0107-04

Exploration of the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis

WU Xiong-jian1 ZHENG Hong2 ZHU Hai-yan1 MAO Zhong-yi1 ZHANG Lei1 XIE Jun1

1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；2.Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China

[Abstract]Objective To investigate the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis.Methods 30 clean SD rats were purchased from Animal Experimental Center，Zhongshan University，and 20 of them were prepared for experimental research.Only ten rats whose bone marrow mesenchym stem cells were extracted and selected as the experimental group for the establishment of rat model with hepatic fibrosis.The hepatic fibrosis and apoptosis of hepatic stellate cells were intervened by bone marrow stem cell mobilization to test these indices.Another group without extraction of bone marrow mesenchymal stem cells was classified into the control group （n=10），which was not performed with intervention.The purity identification of bone marrow mesenchymal stem cells was analyzed，and the hydroxyproline content as well as hepatic stellate cell activation and apoptosis were statistically analyzed.Results The percentage of CD34，CD44，CD45 and CD95 in negative cells were 99.75%，99.51%，99.80% and 95.72%，respectively.After 8-week induction via subcutaneous injection of CCl4，the content of hydroxyproline in the rat′s liver in the experimental group was significantly higher than that before transplantation （P<0.05）.In the experimental group，the content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was much lower compared with that 3-day after transplantation （P<0.05）.In the control group，the content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly higher in comparison with that 3-day after transplantation （P<0.05）.The content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably lower than that in the control group （P<0.05）.The amount of hepatic stellate positive cells in the experimental group one-week after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly less than that in the control group （P<0.05）.The amount of hepatic stellate apoptotic cells 3-day after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably more than that before transplantation and in the control group （P<0.05）.Conclusion The hepatic stellate cell apoptosis induced by bone marrow mesenchymal stem cells may be a major mechanism for the treatment of hepatic fibrosis.

[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation；Hepatic stellate cells；Apoptosis；Hepatic fibrosis；Treatment mechanism

肝纖維化屬于一種病理表現(xiàn)，各種慢性肝病向一定階段發(fā)展后均會(huì)表現(xiàn)出來(lái)，現(xiàn)階段，臨床還沒(méi)有特異性的方法治療肝纖維化及其終末階段的肝硬化。在肝纖維化發(fā)生及緩解中，肝星狀細(xì)胞激活及凋亡異常占有極為重要的地位。近年來(lái)，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究顯示，在肝纖維化或肝硬化的治療中，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能夠?qū)⒁欢ǖ淖饔冒l(fā)揮出來(lái)，但是現(xiàn)階段臨床還未弄清楚其具體機(jī)制[1-2]。為了將有效的理論依據(jù)進(jìn)一步提供給骨髓間質(zhì)肝細(xì)胞對(duì)肝纖維化的治療，本研究探討了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植后肝星狀細(xì)胞凋亡情況及其治療肝纖維化的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

購(gòu)買(mǎi)中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的30只清潔級(jí)SD大鼠，雌雄不限，所有大鼠均統(tǒng)一飼養(yǎng)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF層流環(huán)境中，均食用普通飼料、自由飲水。實(shí)驗(yàn)研究選取20只，體質(zhì)量180～200 g，平均（190±10）g；提取骨髓間質(zhì)干細(xì)胞10只，體質(zhì)量80～100 g，平均（90±10）g。采用GIBCO公司生產(chǎn)的L-DEME培養(yǎng)液、Pharmacia公司生產(chǎn)的密度為1.077 g/ml的percoll淋巴細(xì)胞分離液、Thermo公司生產(chǎn)的小鼠抗大鼠α-SMA 抗體及電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱、hyclone公司生產(chǎn)的胎牛血清、santa公司生產(chǎn)的抗小鼠IgG-FITC熒光二抗、Roche公司生產(chǎn)的TUNEL試劑盒、福建邁新生物科技有限公司生產(chǎn)的免疫組織化學(xué)二抗試劑盒、南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的羥脯氨酸測(cè)試盒。

1.2方法

實(shí)驗(yàn)研究選取20只，將提取骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的10只作為實(shí)驗(yàn)組，建立肝纖維化大鼠模型，骨髓干細(xì)胞動(dòng)員干預(yù)大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞凋亡，檢測(cè)肝纖維化及星狀細(xì)胞凋亡指標(biāo)；將未提取骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的10只作為對(duì)照組，不對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，具體操作如下。

1.2.1肝纖維化大鼠模型的建立 采用40%四氯化碳（CCl4）溶液0.2 ml/100 g大鼠體重，皮下注射，每周2次，共6周，以建立大鼠肝纖維化模型；對(duì)照組采用等量的石蠟油代替CCl4溶液，處理方法相同。處死部分動(dòng)物，留取標(biāo)本，檢測(cè)肝纖維化的發(fā)展情況。

1.2.2骨髓干細(xì)胞動(dòng)員干預(yù)大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞凋亡 肝纖維化大鼠模型建立后即刻皮下注射經(jīng)稀釋的重組人粒細(xì)胞刺激因子（rhG-CSF）30 μg/（kg·d）以動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，連續(xù)7 d；對(duì)照組也于肝纖維化大鼠模型建立后即刻皮下注射等量生理鹽水代替rhG-CSF，連續(xù)7 d。

1.2.3肝纖維化及星狀細(xì)胞凋亡指標(biāo)的檢測(cè) 于動(dòng)員后第0、7、14、28天，以過(guò)量戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，從心臟取全血2～3 ml，離心分離血清，-80℃凍存，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清層黏蛋白（LN）、血清Ⅲ型前膠原（PⅢP）、血清Ⅳ型膠原（ⅣC）、透明質(zhì)酸（HA）等肝纖維化指標(biāo)；全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清總膽紅素（TBiL）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平。取大鼠肝臟組織作Masson三色染色及常規(guī)HE染色并進(jìn)行圖像分析，對(duì)肝組織纖維化程度及膠原纖維百分比進(jìn)行觀察；檢測(cè)α-SMA表達(dá)及肝星狀細(xì)胞的活化情況，在此過(guò)程中應(yīng)用免疫組化法，α-SMA與TUNE雙染法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞的凋亡情況；分光光度法檢測(cè)肝臟羥脯氨酸（Hyp）的含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡的變化。

1.3觀察指標(biāo)

對(duì)兩組大鼠的肝組織羥脯氨酸的含量、病理情況、肝星狀細(xì)胞激活及凋亡情況進(jìn)行觀察和記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的純度鑒定結(jié)果分析

CD34、CD44、CD45、CD95陰性細(xì)胞分別為99.75%、 99.51%、99.80%、95.72%。

2.2兩組大鼠肝臟羥脯氨酸含量的比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠CCl4皮下注射誘導(dǎo)8周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05），對(duì)照組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05）；兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝臟羥脯氨酸含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）（表1）。

2.3兩組大鼠肝星狀細(xì)胞激活及凋亡情況的比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05），對(duì)照組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝星狀凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前及對(duì)照組（P<0.05），兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前的肝星狀凋亡細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

現(xiàn)階段，臨床還沒(méi)有特異性的方法治療肝纖維化及其終末期的肝硬化，在肝纖維化的發(fā)生及逆轉(zhuǎn)過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞激活及凋亡發(fā)揮著極為重要的作用[3]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究顯示，各種損傷因素在肝臟作用后能夠?qū)⒏涡菭罴?xì)胞激活，進(jìn)而造成其大量增殖，最終引發(fā)纖維化[4]。對(duì)肝星狀細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo)能夠?qū)Ω卫w維化進(jìn)行緩解[5]，而肝星狀細(xì)胞凋亡水平在實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中隨著纖維化逆轉(zhuǎn)程度的加重而提升，隨著纖維化逆轉(zhuǎn)程度的減輕而降低，兩者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[6]。

近年來(lái)，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究顯示，在纖維化疾病的治療中，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞能夠?qū)⒁欢ǖ淖饔冒l(fā)揮出來(lái)[7-8]。也有相關(guān)醫(yī)學(xué)研究顯示，肝臟炎癥損傷的發(fā)生受到注射間充質(zhì)干細(xì)胞后歸巢于肝臟的直接而深刻的影響，但是并不受門(mén)靜脈或外周靜脈等注射途徑的直接而深刻的影響[9]。相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者認(rèn)為，磷酸鞘氨醇介導(dǎo)了間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢于肝臟[10]。雖然也有相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者提出，骨髓干細(xì)胞移植后能夠?yàn)楦闻K內(nèi)肌成纖維細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞的形成提供良好的前提條件，其具有瘢痕形成功能，從而使肝纖維化加劇[11]。本研究結(jié)果顯示，CD34、CD44、CD45、CD95陰性細(xì)胞分別為99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。CCl4皮下注射誘導(dǎo)8周后兩組大鼠的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05），對(duì)照組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝臟羥脯氨酸含量顯著高于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05）；兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝臟羥脯氨酸含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟羥脯氨酸含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），與上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向干細(xì)胞分化，參與肝臟損傷修復(fù)，改善肝功能，但這可能不是其對(duì)肝纖維化進(jìn)行緩解的主要作用機(jī)制。由于肝臟本身較為特殊，自身成熟肝細(xì)胞分裂增殖完成了大多數(shù)的損傷修復(fù)及再生，同時(shí)，在肝細(xì)胞的再生過(guò)程中，纖維化過(guò)程中沉積下來(lái)的過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)并不會(huì)隨之降解，因此，應(yīng)該有其他更為重要的基質(zhì)發(fā)揮作用。臨床很有必要對(duì)肝星狀細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞之間的相互作用進(jìn)行研究，這是因?yàn)樵诟卫w維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞發(fā)揮著極為重要的作用[12-15]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后（P<0.05），但對(duì)照組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植1周后的肝星狀陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植3 d后的肝星狀凋亡細(xì)胞數(shù)顯著多于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前及對(duì)照組（P<0.05），兩組大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植前的肝星狀凋亡細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示間充質(zhì)干細(xì)胞能夠?qū)Ω卫w維化進(jìn)程進(jìn)行緩解，同時(shí)也能夠在一定程度上對(duì)炎癥進(jìn)行抑制，減輕炎癥因子損傷干細(xì)胞程度，并為其再生提供良好的前提條件。

綜上所述，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植后誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡可能是其治療肝纖維化的一個(gè)主要機(jī)制，值得臨床充分重視。

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（收稿日期：2017-06-02 本文編輯：祁海文）