錢雪峰，喬美珍，金美娟，馬文霞，楊 波

(1 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006； 2 蘇州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 蘇州 215006)

·論著·

三種用于血液透析和相關(guān)治療用水微生物學(xué)監(jiān)測方法的評價

錢雪峰1，喬美珍1，金美娟1，馬文霞1，楊 波2

(1 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006； 2 蘇州市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 蘇州 215006)

目的評價三種方法用于監(jiān)測血液透析和相關(guān)治療用水微生物檢測的效果。方法在某次飛行檢查中采集36所受檢單位的血液透析液和透析用水72份，分別采用血瓊脂平皿(35℃，72 h)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)平皿(35℃，72 h)、R2A營養(yǎng)瓊脂(23℃,168 h)三種方法進行培養(yǎng)，比較三種方法菌落計數(shù)、菌落和超干預(yù)值(≥50 CFU/mL)檢出率的差異。結(jié)果采用三種方法對透析液和透析用水進行檢測，血瓊脂平皿、TSA平皿、R2A營養(yǎng)瓊脂菌落檢出率分別為40.28%、63.89%和69.44%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.16，P<0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示，R2A營養(yǎng)瓊脂和TSA平皿檢出率高于血瓊脂平皿。血瓊脂平皿與R2A營養(yǎng)瓊脂、TSA與R2A營養(yǎng)瓊脂檢出菌落計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z值分別為-4.515、-6.970，均P<0.05)。血瓊脂平皿、TSA平皿、R2A營養(yǎng)瓊脂法檢測透析液和透析用水菌落數(shù)，超干預(yù)值檢出率分別為1.39%、4.17%和20.83%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.83，P<0.05)，R2A營養(yǎng)瓊脂檢出率高于其他兩種方法。結(jié)論R2A營養(yǎng)瓊脂和TSA平皿檢出率優(yōu)于血瓊脂平皿，R2A營養(yǎng)瓊脂超干預(yù)值檢出率高于TSA平皿和血瓊脂平皿，R2A營養(yǎng)瓊脂(23℃,168 h)用于血液透析和相關(guān)治療用水微生物監(jiān)測優(yōu)于其他兩種方法。

血液透析； 透析液； 透析用水； 微生物學(xué)監(jiān)測

[Chin J Infect Control，2017，16(8)：698-701]

以代謝方式來分類，細(xì)菌可分為藍(lán)細(xì)菌、自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌，水生細(xì)菌即是乏營養(yǎng)異養(yǎng)菌。能在透析液和透析用水中檢測到的細(xì)菌主要是革蘭陰性非發(fā)酵菌，如假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、羅爾斯通菌屬、土壤桿菌屬等。革蘭陽性菌相對較少，主要為棒狀桿菌屬和腸球菌屬。真菌所占比例低于細(xì)菌，主要為近平滑假絲酵母菌和暗色絲狀真菌[1]。血液透析患者如果每周透析3次，每次接觸150 L透析液，每年將暴露于20 000 L以上的透析液中?；颊呷艚邮苎和肝鰹V過治療，每年至少會有3 000 L以上的液體進入血液循環(huán)系統(tǒng)[2]。如果透析液或透析用水中微生物含量超標(biāo)，微生物就有機會通過透析膜進入血液。血液透析和治療用水中細(xì)菌短期嚴(yán)重污染會導(dǎo)致菌血癥，甚至敗血癥，即使低水平污染亦可引起熱原反應(yīng)。長期污染更是會導(dǎo)致患者慢性炎性反應(yīng)和對促紅細(xì)胞生成素反應(yīng)性降低，加速機體蛋白分解、減少蛋白合成，并可能導(dǎo)致透析相關(guān)淀粉樣變[3-4]。因此，全球許多國家和地區(qū)均要求對透析和相關(guān)治療用水定期進行微生物學(xué)監(jiān)測。本研究采用血瓊脂平皿、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)、R2A營養(yǎng)瓊脂進行血液透析和相關(guān)治療用水的微生物學(xué)檢測，比對三種方法的差異，探索適用于監(jiān)測透析液和透析用水中微生物的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2016年3月3—7日某市醫(yī)院感染質(zhì)量控制中心聯(lián)合市腎臟病質(zhì)量控制中心和市疾病預(yù)防控制中心，對本市范圍內(nèi)二級以上有血透室單元的醫(yī)療機構(gòu)進行飛行檢查。采集36所醫(yī)療機構(gòu)血液透析室的透析液和透析用水72份。透析液采樣部位：管道尾端透析機；透析用水采樣部位：回路水采樣口。

1.2 檢測方法 將72份透析液和透析用水送疾病預(yù)防控制中心，每份標(biāo)本取1 mL樣本采用涂布平板法接種于TSA上，35℃培養(yǎng)48 h，48 h后若陰性可于72 h后再檢查計數(shù)。同時平行樣留醫(yī)院感染質(zhì)量控制中心，取1mL樣本采用涂布平板法接種于血瓊脂平皿35℃培養(yǎng)48 h，48 h后若陰性可于72 h后再檢查計數(shù)；取1 mL樣本采用涂布平板法接種于R2A營養(yǎng)瓊脂23℃培養(yǎng)168 h(7 d)，進行菌落計數(shù)。實驗全程注意無菌操作，三種方法均設(shè)置陰性對照。

1.3 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，以透析液和透析用水中是否有菌落檢出作為檢出率標(biāo)準(zhǔn)，以YY0572—2015《血液透析液及相關(guān)治療用水》微生物污染物干預(yù)水平(50 CFU/mL)為超干預(yù)值檢出率標(biāo)準(zhǔn)，菌落檢出率和超干預(yù)值檢出率比較采用χ2檢驗；采用Wilcoxon秩和檢驗對不同方法檢出菌落計數(shù)的差異進行分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透析液和透析用水菌落檢出情況 采用三種方法對透析液和透析用水進行檢測，血瓊脂平皿、TSA平皿、R2A營養(yǎng)瓊脂菌落檢出率分別為40.28%、63.89%和69.44%，檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.16，P<0.05)；兩兩比較結(jié)果顯示，R2A營養(yǎng)瓊脂和TSA平皿檢出率高于血瓊脂平皿，見表1。因透析液和透析用水檢出的具體菌落計數(shù)資料不符合正態(tài)性，采用Wilcoxon檢驗進行比較。血瓊脂平皿與R2A營養(yǎng)瓊脂檢出菌落計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.515，P<0.05)；TSA與R2A營養(yǎng)瓊脂檢出菌落計數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-6.970，P<0.05)。見表2。

表1 三種方法檢測透析液和透析用水菌落檢出率比較

表2 三種方法檢測透析液和透析用水菌落檢出情況

2.2 透析液和透析用水菌落數(shù)超干預(yù)值情況 透析液和透析用水菌落數(shù)超干預(yù)值檢出率：血瓊脂平皿、TSA平皿、R2A營養(yǎng)瓊脂法分別為1.39%、4.17%和20.83%，三種方法超干預(yù)值檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.83，P<0.05)，R2A營養(yǎng)瓊脂檢出率高于血瓊脂平皿、TSA平皿兩種方法的檢出率(χ2值分別為11.88、9.14，P<0.017)。見表3。

表3 三種方法檢測透析液和透析用水菌落數(shù)超干預(yù)值情況

3 討論

我國YY0572《血液透析液和相關(guān)治療用水》給出了制備透析液用水在微生物學(xué)方面的最低要求。2005年版的標(biāo)準(zhǔn)操作方法是要求培養(yǎng)基應(yīng)為TSA或等價物，35℃～37℃下培養(yǎng)48 h，48 h后若陰性可于72 h后再檢查[5]。2015年版提出培養(yǎng)基宜選用胰化蛋白胨葡萄糖瓊脂(TGEA)、R2A營養(yǎng)瓊脂或其他確認(rèn)能提供相同結(jié)果的培養(yǎng)基，推薦使用17℃～23℃的溫度培養(yǎng)168 h(7 d)，確認(rèn)能提供相同培養(yǎng)結(jié)果的其他培養(yǎng)時間和溫度也適用[6]。實際情況是，我國醫(yī)療機構(gòu)目前大多使用血瓊脂平皿35℃～37℃培養(yǎng)48 h，檢測透析液和相關(guān)治療用水中細(xì)菌菌落數(shù)，因其方法簡便、培養(yǎng)基易得，可檢出大多數(shù)致病菌；疾病預(yù)防控制中心和第三方檢測機構(gòu)多采用TSA平皿35℃～37℃下培養(yǎng)48～72 h。本研究比較血瓊脂平皿、TSA、R2A營養(yǎng)瓊脂檢測血液透析和相關(guān)治療用水菌落數(shù)存在差異。

全球許多國家和地區(qū)對透析液和透析用水的質(zhì)量都有推薦要求、標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測方法，應(yīng)用最廣泛的是美國醫(yī)療器械進展委員會(The Association for the Advancement of Medical Instrumentation, AAMI)推薦、歐洲最佳實踐指南(The European Best Practice Guideline, EBPG)[7]和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization, ISO)標(biāo)準(zhǔn)。AAMI 2004標(biāo)準(zhǔn)建議使用TSA培養(yǎng)基，在30℃～37℃下培養(yǎng)48 h[8]，2011年開始和ISO標(biāo)準(zhǔn)一樣，推薦R2A或TGEA培養(yǎng)基在17℃～23℃下培養(yǎng)7 d[9-10]。西班牙腎臟病學(xué)會推薦使用R2A培養(yǎng)基，在23℃～27℃下培養(yǎng)7 d[1]。

革蘭陰性水生細(xì)菌在經(jīng)蒸餾、去離子、反滲透和軟化處理所制備的透析用水中具有快速倍增的能力。用這些水制備的透析液同樣也為細(xì)菌提供了一個非常好的生長環(huán)境[5]。在水系統(tǒng)的微生物監(jiān)測中，如果沒有主動消毒策略和敏感性高的監(jiān)測培養(yǎng)技術(shù)，大量微生物的代謝產(chǎn)物就有干擾血透者免疫防御系統(tǒng)的風(fēng)險[11]。水生細(xì)菌與內(nèi)毒素的相關(guān)性較低，研究[12]表明，430 000個懸浮銅綠假單胞菌才貢獻(xiàn)1 EU/mL內(nèi)毒素水平。正因如此，僅單獨監(jiān)測透析液和透析用水的內(nèi)毒素水平是不夠的。

透析液中的細(xì)菌數(shù)通常高于透析用水，因為碳酸氫鹽成分有利于細(xì)菌定植[13]。透析液濃縮物的細(xì)菌學(xué)監(jiān)測很難標(biāo)準(zhǔn)化，因為可在環(huán)境中繁殖的微生物已進化出相應(yīng)的應(yīng)對機制，阻礙其在普通人工培養(yǎng)基上被檢出。加入碳酸氫鹽和氯化鈉的低營養(yǎng)培養(yǎng)基可提高細(xì)菌檢出的敏感性[14-15]。當(dāng)使用一種敏感性不高的培養(yǎng)方法評估透析用水處理系統(tǒng)和透析液是否充分消毒時，會有低估微生物感染發(fā)生可能的風(fēng)險，最終導(dǎo)致細(xì)菌超標(biāo)、細(xì)菌生物膜形成和代謝產(chǎn)物通過透析膜進入患者體內(nèi)導(dǎo)致疾病[16]。目前透析液和透析用水微生物學(xué)監(jiān)測方法的主流觀點是傾向于使用低營養(yǎng)培養(yǎng)基，降低培養(yǎng)溫度和延長培養(yǎng)時間,認(rèn)為培養(yǎng)基營養(yǎng)太豐富會殺死水生細(xì)菌[17]。但同時也有學(xué)者認(rèn)為此方法并不適合所有水生微生物的生長，有些細(xì)菌更適合在富營養(yǎng)培養(yǎng)基和較高溫度條件下生長[18]。還有一個必須考慮的因素是水中病原菌、水生藻類和真菌的影響，雖然就水生藻類和真菌在透析液和透析用水中的數(shù)量及其臨床意義的研究甚少，但通常認(rèn)為其最大允許數(shù)量應(yīng)低于細(xì)菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的10倍[1]。我們建議在接種R2A或TGEA等低營養(yǎng)培養(yǎng)基的同時，再接種一塊血平皿置于35℃培養(yǎng)48 h，一塊沙保羅瓊脂(Sabouraud argar)平皿置于25℃培養(yǎng)168 h。接種血平皿是為提高對營養(yǎng)要求高的快生長病原菌檢出率，接種沙保羅平皿是為能檢出水中的真菌，既能提高對乏營養(yǎng)水生細(xì)菌的檢出率，又能兼顧需高營養(yǎng)的病原菌和真菌的監(jiān)測。

國家食品藥品監(jiān)督管理總局將于2017年1月1日實施新的血液透析及相關(guān)治療用水標(biāo)準(zhǔn)YY0572-2015，其中對內(nèi)毒素和細(xì)菌數(shù)提出了更高的要求，細(xì)菌數(shù)是不超過100 CFU/mL，干預(yù)值是50 CFU/mL[6]，對微生物學(xué)監(jiān)測方法的敏感性也提出了更高的要求。整個標(biāo)準(zhǔn)采用了制藥GMP注射用水的熱源標(biāo)準(zhǔn)，對透析用水系統(tǒng)消毒的要求會越來越高。各地疾病預(yù)防控制中心也應(yīng)根據(jù)新標(biāo)準(zhǔn)進行水質(zhì)監(jiān)控。各血液透析中心應(yīng)提前做好系統(tǒng)升級，以配合新標(biāo)準(zhǔn)的實施。

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(本文編輯：黃昕)

Threemethodsformicrobiologicalmonitoringondialysateanddialysiswaterforhemodialysis

QIANXue-feng1,QIAOMei-zhen1,JINMei-juan1,MAWen-xia1,YANGBo2

(1TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China； 2SuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Suzhou215006,China)

ObjectiveTo evaluate detection effect of three methods on monitoring microbes in dialysate and dialysis water for hemodialysis.MethodsSeventy-two dialysate and dialysis water specimens were collected from 36 medical institutions, specimens were cultured with three methods: blood agar plate incubated at 35℃ for 72 hours, Tryptic soy agar(TSA)plate incubated at 35℃ for 72 hours, and Reasoner’s 2A agar (R2A agar) plate incubated at 23℃ for 168 hours, colony counts, isolation of colony, and detection rate of colony exceeding action level(≥50 CFU/mL) were compared among three methods.ResultsThe colony isolation rates of microbes in dialysate and dialysis water detected by blood agar plate, TSA plate and R2A plate were 40.28%, 63.89%, and 69.44% respectively, difference was significant(χ2=14.16，P<0.05)；pairwise comparison showed that isolation rates of colony on R2A agar plate and TSA plate were higher than blood agar plate. There was significant difference in isolated colony count between blood agar plate and R2A agar plate, TSA plate and R2A agar plate respectively(Z=-4.515, -6.970 respectively，bothP<0.05). The rates of isolated colony exceeding action level in dialysate and dialysis water detected by blood agar plate, TSA plate, and R2A agar plate were 1.39%, 4.17%, and 20.83% respectively, difference was significant(χ2=19.83，P<0.05)，detection rate of R2A agar plate was higher than the other two methods.ConclusionThe detection rate of colony by R2A agar plate and TSA plate are better than blood agar plate, detection rate of colony exceeding action level by R2A agar plate is higher than TSA plate and blood agar plate, R2A agar plate for microbial monitoring(23℃,168 h) on dialysate and dialysis water is superior to the other two methods.

hemodialysis; dialysate; dialysis water; microbiological monitoring

2017-01-03

國家自然科學(xué)基金(81501425)

錢雪峰(1974-)，男(漢族)，江蘇省蘇州市人，副主任檢驗師，主要從事病原生物研究。

喬美珍 E-mail:qiaomeizhen99@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.08.002

R459.5

A

1671-9638(2017)08-0698-04