黎素菊+陳樹鵬+洪捷嫻+陳曉銜

摘 要：本文主要針對(duì)高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的孔雀石綠展開(kāi)了探討，通過(guò)結(jié)合具體的試驗(yàn)實(shí)例，對(duì)材料與方法作了詳細(xì)的闡述，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作了分析，以期能為有關(guān)方面的需要提供參考借鑒。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；測(cè)定；水產(chǎn)品；孔雀石綠

孔雀石綠為三苯甲烷類工業(yè)染料， 在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以有效的預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動(dòng)物的水霉病、鰓霉病和小蟲病，并能保持水產(chǎn)品的新鮮度。但是若人體攝入孔雀石綠，將會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生極為嚴(yán)重的危害。因此，對(duì)水產(chǎn)品必要要有嚴(yán)格的測(cè)定，以防止孔雀石綠對(duì)人體健康帶來(lái)不必要的影響。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料。試劑有乙腈（德國(guó)默克，色譜純）；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）；中性氧化鋁固相萃取柱（supelco公司，1g/3mL）；濾膜（上海安譜，0.45μm，有機(jī)相）。標(biāo)準(zhǔn)溶液：孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（0.1g，Sigma）；100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品10mg（精確到0.1mg），用乙腈溶解并定容于100mL容量瓶中；1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取1.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容；標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0mL標(biāo)準(zhǔn)中間液分裝于100mL容量瓶中，用乙腈定容，制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。

儀器有高效液相色譜儀（LC-20AB，島津），配有熒光檢測(cè)器；勻漿機(jī)（IKA，德國(guó)），漩渦混合器（IKA，德國(guó)）；離心機(jī)（Sigma3K30，德國(guó)）；超聲波清洗器（KQ-2200DB，昆山市超聲儀器公司）；固相萃取儀（MEDIWAX，美國(guó)）；多樣品自動(dòng)濃縮儀（V-700，BUCHI）；超純水器（arium ? comfort I，sartorius）。

2.色譜分析條件。色譜柱：VarianPolarisC185μm4.6mm×250mm；流動(dòng)相：乙腈：乙酸銨緩沖液（80：20，v/v）；流速1.0mL/min；柱溫30℃；激發(fā)波長(zhǎng)265nm、發(fā)射波長(zhǎng)360nm；進(jìn)樣量20μL。

3.樣品的前處理。（1）提取。稱量5.00g（精確至0.01g）試樣于50mL離心管中，加入15mL乙腈，漩渦混合2min，10000r/min勻漿提取30s，6000r/min離心10min，取上清液至自動(dòng)濃縮樣品瓶中。另取一支50mL離心管，加入15mL乙腈，清洗勻漿機(jī)刀頭，洗滌液轉(zhuǎn)移至前一離心管。用玻璃棒搗碎離心管中的樣品，漩渦混合2min，超聲波提取10min，6000r/min離心10min，上清液合并至自動(dòng)濃縮樣品瓶中。（2）濃縮。將上清液放入多樣品自動(dòng)濃縮儀，50℃下濃縮至近干，用5mL乙腈溶解殘?jiān)?。?） 凈化。中性氧化鋁柱用5mL乙腈活化，樣液過(guò)柱，用自動(dòng)濃縮樣品瓶收集流出液，5mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，合并流出液。（4）濃縮。將上清液放入多樣品自動(dòng)濃縮儀，50℃下濃縮至近干，乙腈定容至1mL，渦旋混勻，用0.45μm濾膜過(guò)濾，按照1.2的方法上機(jī)測(cè)定。

二、結(jié)果與分析

1.提取液的選擇。標(biāo)準(zhǔn)中選擇乙腈及乙酸鹽緩沖液提取，同時(shí)加入鹽酸羥胺和對(duì)甲苯磺酸，雖然提取效果很好，但是試驗(yàn)表明，僅用乙腈提取，回收率也較高。該法將提取液進(jìn)行簡(jiǎn)化，減少了試劑的浪費(fèi)，提高了提取效率。

2.提取方式的選擇。應(yīng)用《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定（GB/T19857-2005）》，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法僅用勻漿機(jī)來(lái)提取。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品僅用勻漿機(jī)提取，其回收率較差。反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用漩渦混合、超聲波及勻漿機(jī)提取的效果好，回收率較高。

3.色譜條件的選擇

（1）色譜柱的選擇。基于流動(dòng)相的調(diào)整上，用C18作為分離色譜柱，因其具有理想的峰形、分離度、目標(biāo)峰保留時(shí)間，且應(yīng)用廣泛。

（2）流動(dòng)相的選擇。反復(fù)將乙腈和乙酸銨緩沖液的配比進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，峰形較好，保留時(shí)間適中，且分離度理想，目標(biāo)峰在11.2min出峰，雜峰都可以在15min以內(nèi)流出（圖1、2）。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性、線性范圍及檢出限?？兹甘G工作液濃度在1.0～50.0μg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。以峰面積（Y）為縱軸，工作液濃度（X）為橫軸，得到良好的線性關(guān)系，建立回歸方程為Y=37190X+10109，r2=0.9997。按3倍信噪比計(jì)算，得出方法檢出限為1.0μg/kg。

5.方法的準(zhǔn)確度。選擇鯽魚、草魚、河蝦空白樣品各1個(gè)，每個(gè)樣品稱取3份，分別準(zhǔn)確加入1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1mL，測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)。上述水產(chǎn)品的平均加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為89.0%～96.5%、2.0%～2.2%（表1）。

三、結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)，建立了高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠的分析方法。結(jié)果表明，選擇乙腈為提取液，采用漩渦混合、超聲波及勻漿機(jī)提取方式，C18柱作分離色譜柱，乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，分離效果較好，孔雀石綠檢出限為1.0μg/L，加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為89.0%～96.5%、2.0%～2.2%。

四、結(jié)語(yǔ)

綜上所述，人體攝入孔雀石綠，將會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生極為嚴(yán)重的危害。因此，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定非常必要，而在高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠的試驗(yàn)中，此方法能科學(xué)準(zhǔn)確的得出孔雀石綠的含量，值得應(yīng)用推廣。

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