原向偉+黃秀芳

[摘要] 目的 研究姜黃素對骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討其機(jī)制。 方法 采用姜黃素單體處理人骨肉瘤U2OS細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞增殖活力，采用流式細(xì)胞術(shù)和DNA Ladder檢測凋亡，通過Westernblot法檢測p53和caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果 4、8、16、32、64μmol/L姜黃素處理U2OS細(xì)胞48h，生長抑制率為：（9.21±3.11）%、（16.85±3.95）%、（29.57±5.33）%、（52.30±6.07）%和（79.16±6.78）%。姜黃素（16μmol/L）在24、48和72h均可誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡，凋亡率為：（18.8±3.05）%、（29.6±5.22）%和（57.3±6.62）%，姜黃素（16μmol/L）作用72h后，DNA電泳顯示梯形條帶改變。并且姜黃素作用48h可明顯上調(diào)p53的表達(dá)和caspase-3的活化。 結(jié)論 姜黃素可抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖，并通過p53-caspase-3通路誘導(dǎo)凋亡。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤；姜黃素；細(xì)胞增殖；凋亡

[中圖分類號] R738.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）13-30-04

[Abstract] Objective To evaluate the effect of curcumin on proliferation and apoptosis in osteosarcoma cells and study its mechanisms. Methods Human osteosarcoma U2OS cells were treated with curcumin monomer.Trypan blue exclusion test was performed to evaluate the cell proliferation.Flow cytometry analysis and DNA Ladder assay were performed to examine the cell apoptosis.Westernblot assay was used to detect the expression of p53 and caspase-3. Results After treatment with curcumin （4，8，16，32，64μmol/L） for 48h，the inhibition rates of U2OS cells were （9.21±3.11）%，（16.85±3.95）%，（29.57±5.33）%，（52.30±6.07）%and（79.16±6.78）%.Curcumin （16μmol/L） induced apoptosis in U2OS cells at 24，48，72h.The apoptotic rates were （18.8±3.05）%，（29.6±5.22）% and（57.3±6.62）%.DNA electrophoresis showed ladder change after treatment with curcumin（16μmol/L） for 72h.The expression of p53 and caspase-3 activation were increased after curcumin treatment for 48h. Conclusion Curcumin decreases proliferation and induces apoptosis through p53-caspase-3 pathway in osteosarcoma U2OS cells.

[Key words] Osteosarcoma；Curcumin；Proliferation；Apoptosis

骨肉瘤是人類最常見的骨組織原發(fā)惡性腫瘤，常發(fā)于青少年，惡性度極高，目前常用治療方法為新輔助化療和手術(shù)治療，但療效差，預(yù)后不佳[1-2]，因此尋找治療骨肉瘤的新方法具有重要意義。中藥抗腫瘤已有上千年的歷史，隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，針對具有抗腫瘤效應(yīng)的部分中草藥，提取其有效成分并進(jìn)行深入研究，已成為腫瘤治療的研究新方向[3]。姜黃素（curcumin）是提取自中藥姜黃的一種單體植物多酚，具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗炎、抗凝、降血脂等[4-5]，其可以抑制肺癌、胃癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長[6-8]，提示了姜黃素在腫瘤治療中的應(yīng)用價值。本研究探討姜黃素對人骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為拓展骨肉瘤的治療新方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人類骨肉瘤U2OS細(xì)胞來自中山大學(xué)病理教研室，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清（購自GIBCO公司）、100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素的DMEM（購自GIBCO公司），培養(yǎng)于5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）。均使用對數(shù)生長期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.2 藥物處理

姜黃素單體（購自Sigma公司）溶于DMSO，儲存于-20℃?zhèn)溆茫捎眉?xì)胞培養(yǎng)液稀釋為工作濃度。

1.3 臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞增殖

收集各種細(xì)胞，采用0.4%臺盼藍(lán)（Sigma公司產(chǎn)品）進(jìn)行染色，死細(xì)胞染為藍(lán)色，活細(xì)胞不染色，隨機(jī)選擇10個高倍視野（400×），記錄活細(xì)胞數(shù)目。計算公式為細(xì)胞生長抑制率=[（對照組活細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)）/對照組活細(xì)胞數(shù)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取均值作為統(tǒng)計資料。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測U2OS細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，PBS清洗離心；70%乙醇固定過夜；細(xì)胞經(jīng)10μmol/L的碘化丙啶（PI，Sigma公司產(chǎn)品）染色5min，4℃避光30min；上流式細(xì)胞儀（BD FACS Calibur，美國）用488nm激發(fā)光檢測細(xì)胞DNA含量，LYSIS軟件分析凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取均值作為統(tǒng)計資料。

1.5 DNA Ladder法檢測細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞，PBS清洗后加入0.8mL的DNAzol（Invitrogen公司產(chǎn)品），室溫放置數(shù)分鐘，4℃離心15min，將上清移入EP管，加入0.4mL無水乙醇混合，4℃離心10min，棄上清后加入75%乙醇洗2次，待乙醇揮發(fā)干凈后加入適量TE溶解基因組DNA，取適量DNA在含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠上電泳3小時，紫外線激發(fā)下觀察梯形條帶，并使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.6 Westernblot法檢測p53和caspase-3的表達(dá)

收集各組細(xì)胞，清洗離心后加入裂解液提取蛋白，采用BCA法定量，配膠加樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，采用含5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST）4℃封閉過夜；p53和caspase-3抗體（均購自Santacruz公司）1∶1000稀釋后室溫封膜2h，TBST清洗，加入二抗4℃過夜，再次TBST清洗，最后ECL發(fā)光，顯影，定影，收集圖像。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖的影響

4、8、16、32、64μmol/L姜黃素處理U2OS細(xì)胞48h后，與對照組相比，U2OS細(xì)胞的增殖受到抑制，各組細(xì)胞生長抑制率如表1所示，隨著姜黃素濃度的增加，生長抑制率隨之增加，表現(xiàn)出明顯劑量依賴性特征，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 姜黃素可誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡

我們采用姜黃素16μmol/L處理U2OS細(xì)胞24、48、72h后，流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡率隨之增加，表現(xiàn)出明顯時間依賴性特征，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 姜黃素誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞產(chǎn)生DNA Ladder變化

細(xì)胞凋亡時，基因組DNA會在核小體單位之間的連接處斷裂，電泳后可形成梯形電泳條帶（DNA Ladder），是凋亡的特征性表現(xiàn)，也是鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[9]。我們采用姜黃素（16μmol/L）處理U2OS細(xì)胞24、48、72h后，抽提細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果顯示，與空白對照及其他各處理時間組相比，姜黃素（16μmol/L）處理72h的U20S細(xì)胞出現(xiàn)明顯的梯形條帶（圖1），從形態(tài)學(xué)證明凋亡的發(fā)生。

2.4 姜黃素上調(diào)p53的表達(dá)和caspase-3的活化

不同濃度的姜黃素（4μmol/L、16μmol/L、64μmol/L）處理U2OS細(xì)胞48h后，如圖2所示，Westernblot結(jié)果顯示抑癌基因p53蛋白水平的表達(dá)隨濃度的增加逐漸升高，在64μmol/L組，caspase-3出現(xiàn)明顯活化，裂解出17KD的活性caspase-3片段。

3 討論

近千年來，作為極具中國特色的醫(yī)學(xué)理論，中醫(yī)藥已經(jīng)在治療人類疾病方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，作為中醫(yī)藥的重要組成部分，以自然界植物為主要來源的中藥也獲得世界范圍內(nèi)的認(rèn)可，并獲得更為廣闊的市場和前景[10-11]。目前，關(guān)于中藥抗腫瘤的現(xiàn)代化研究已有不少報道，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤機(jī)制涉及凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、抑制轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)分化等多個方面[12-14]。然而，在中草藥提取物抗骨肉瘤方面罕有報道，并且相關(guān)研究選藥較為局限，缺乏作用機(jī)制研究。

骨肉瘤是青少年最常見的骨組織原發(fā)惡性腫瘤，早期肺轉(zhuǎn)移率高，傳統(tǒng)手術(shù)+化療對于部分不敏感患者療效差，導(dǎo)致致死致殘率高，預(yù)后不佳[15]，因此開發(fā)新的抗骨肉瘤藥物有著不言而喻的重要意義。我們采用中藥姜黃的提取物姜黃素處理骨肉瘤U2OS細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其對U2OS細(xì)胞的增殖存在明顯的抑制作用，并且抑制效應(yīng)具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

CAD（caspase activated DNAase）是細(xì)胞中一種能切割染色質(zhì)的核酸酶，可被caspase-3激活[16]，CAD可識別DNA序列中的特定位點(diǎn)，將細(xì)胞基因組DNA在核小體單位之間的連接處剪斷，從而形成180～200bp或其整數(shù)倍大小的寡核昔酸片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會出現(xiàn)梯形電泳條帶，是凋亡的特征性表現(xiàn)，因而成為鑒定凋亡的經(jīng)典指標(biāo)[9]。我們采用流式細(xì)胞術(shù)和基因組DNA電泳梯形條帶實(shí)驗(yàn)，從兩方面證實(shí)姜黃素具有誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡的作用，并且呈明顯的時間依賴關(guān)系。

p53是經(jīng)典的抑癌基因[17]，以p53為中心的凋亡通路包括Bax、Bcl-2、p21、Noxa等下游基因以及執(zhí)行基因組剪切的caspase（半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶）家族和PARP等效應(yīng)因子，是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡通路[18-19]。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素可明顯增加p53的表達(dá)，從而活化p53凋亡通路。caspase家族中caspase-3是重要的效應(yīng)成員，在正常情況下，caspase-3以無活性的酶原形式存在，經(jīng)過p53通路對凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)生活化，裂解出17KD的活化片段，進(jìn)一步激活其底物PARP，剪切基因組DNA，完成凋亡。

此外據(jù)文獻(xiàn)報道姜黃素還具有其他抗腫瘤機(jī)制，如姜黃素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和抑制AKT/mTOR信號通路的活化而抑制人類黑色素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[20]；姜黃素可下調(diào)Wnt/β-catenin通路，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡[21]；姜黃素與5-氟脲嘧定聯(lián)合作用于鼻咽癌細(xì)胞，可抑制Bcl-2的表達(dá)，并增強(qiáng)Bax的表達(dá)，從而改變Bcl-2/Bax比率，并通過抑制NF-κB活性而誘導(dǎo)凋亡，最終抑制鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞的生長[22]；姜黃素可抑制Akt的磷酸化同時增強(qiáng)p38MAPK磷酸化，從而在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中促進(jìn)G2/M期細(xì)胞周期停滯和凋亡[23]。進(jìn)一步研究姜黃素在抗骨肉瘤中的分子機(jī)制可為開發(fā)姜黃素治療骨肉瘤提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-04-26）