鄧漢超

胰蛋白酶抑制劑（CpTI）（SCK基因）是一種植源性的殺蟲蛋白，能殺死大多數(shù)農(nóng)業(yè)害蟲。其作用是與害蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶結(jié)合形成酶抑制劑復(fù)合物，阻斷或削弱消化酶的蛋白水解作用。進(jìn)而反饋神經(jīng)系統(tǒng)促使害蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)， 最終導(dǎo)致死亡?；谒苯幼饔煤οx，并且很難產(chǎn)生抗藥性。為此它已成為目前除Bt 毒蛋白外使用得最為廣泛的殺蟲蛋白。為進(jìn)行食品的安全性評(píng)價(jià)需要獲得大量的CpTI 蛋白，為此建立一套表達(dá)和大量制備高純度SCK重組蛋白，顯得十分迫切且意義重大。本文以大腸桿菌為宿主，建立一套表達(dá)和大量制備高純度SCK重組蛋白體系，可為SCK植物蛋白檢測(cè)用抗體提供穩(wěn)定免疫性抗原，同時(shí)也可為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供穩(wěn)定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

含有SCK基因的水稻粉， pet30a載體，感受態(tài)細(xì)胞BL21。

1.1.2 試劑

NdeI和XhoI內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq酶、卡那霉素等。

1.2 方法

1.2.1 SCK基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)已知的SCK基因序列（GenBank登錄號(hào)EU088405.1），設(shè)計(jì)兩端的引物，并分別引人了NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)，上游引物F：TATACATATGATGATGGTGCTGAAGGTGTGTG，下游序列R：GGTGCTCGAGCTCATCATCTTCATCACG。

用Qiagen試劑盒提取DNA，以DNA為模板，PCR反應(yīng)條件：94℃，5 min；94℃ 40S，55℃ 30s，72℃ 1min，30 cycles；72℃ 2min；10 2min。

利用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物與pet30a連接，42℃ 熱擊轉(zhuǎn)化BL21，涂于含卡那霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。將菌落PCR驗(yàn)證正確的菌落重新接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測(cè)序分析，檢測(cè)連接方向與序列的正確性，

1.2.2 優(yōu)化條件的表達(dá)和純化

測(cè)序正確的菌株，接菌液到250ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，過夜培養(yǎng)。第二天取過夜培養(yǎng)的250ml菌液與等體積LB液體培養(yǎng)基（Amp+）混合，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD=0.6-0.8，IPTG誘導(dǎo)（125ul（0.8M）IPTG/250ml菌液），2.5h后收菌。大量收菌：用400ml大離心筒，6000rpm，離心5min。棄上清。超聲破菌：沉淀用20-30ml 10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，超聲。電泳確定表達(dá)形式：取100ul超聲（500W ，30次，每次10秒，間隔15秒）后的菌懸液，13000rpm，離心10min，取50ul上清至另一EP管，加50ul 2×溴酚藍(lán)Buffer，100℃煮5min，電泳，上清去除干凈后沉淀用50ul 10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散，加入50ul 2×溴酚藍(lán)Buffer，100℃煮5min，電泳。剩余的超聲離心后上清和沉淀分別凍存，其中沉淀凍存前用適量10mMTris-HCl（pH8.0）溶液吹散。

純化：取200ul bead 加入1ml裂解液（50mM Tris（pH7.5），100mM NaCl，0.1% TritonX-100），重懸，2000rpm離心2min，重復(fù)3次。每500ml培養(yǎng)液的菌體加入20ml裂解液重懸，超聲，12000rpm離心10min。取上清與經(jīng)過處理的200ul Glutathione Sepharose 4B bead混合搖勻，4℃條件下翻轉(zhuǎn)搖動(dòng)過夜。2000rpm離心2min，上清轉(zhuǎn)至另一管中，留樣電泳，bead轉(zhuǎn)入1.5mlEP管。5，用1.5ml洗液I（50mM Tris（pH7.5），500mM NaCl，0.1% TritonX-100）洗3次（2000 rpm離心2min，加液后重懸）。用0.5ml裂解液重懸Glutathione Sepharose 4B bead。加入0.5ml 2×loading buffer，混勻，沸水煮5min，12000rpm離心1min，取上清。電泳檢測(cè)純化效果。

1.2.3 目的蛋白的Brandford 定量分析

吸20mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白6ul 以 0.15mmol/L NaCl 稀釋40 倍至0.5mg/ml；分別在兩組各 4 支試管中加入 10ul、20ul、30ul、40ul，然后再以 0.15mmol/L NaCl補(bǔ)足至總體積 200ul，同時(shí)取一試管僅加 200ul 0.15mmol/LNaCl 作為調(diào)零用；取純化產(chǎn)物 20ul，也以 0.15mmol/L NaCl 補(bǔ)足至總體積 200ul；每管加入考馬斯亮藍(lán) G-250 染液 2ml 振蕩混勻后室溫靜置 30 分鐘；于 DU series600 全波長(zhǎng)分光光度計(jì)中讀取 A590 值，由儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算樣品蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將經(jīng)PCR獲得的全場(chǎng)序列以NdeI和XhoI雙切后，連接入經(jīng)同樣雙酶切的線性化pet30a載體，帶有SCK基因的質(zhì)粒載體為pT-SCK。

以通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序克?。ú糠纸Y(jié)果見圖2和圖3），測(cè)序結(jié)果經(jīng)過BLAST比對(duì)，測(cè)序序列與原NCBI序列完全一致。

2.2 目標(biāo)蛋白的表達(dá)純化和定量分析

離心收集到的細(xì)菌菌體，在經(jīng)過超聲波徹底破碎和離心后，通過SDS-PAGE電泳分別檢測(cè)該細(xì)胞上清和沉淀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCK目標(biāo)蛋白在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成少量包涵體，而是全部以可溶性方式存在于細(xì)胞上清液中。該細(xì)胞上清液經(jīng)鎳柱純化后，便可得到高純度的目標(biāo)蛋白，將150mM咪唑洗脫獲得的組分對(duì)10mM Tris-HCl透析后，該組分的電泳純度>85%，利用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度為0.9mg/ml。

3 討論

本研究構(gòu)建了一個(gè)含有SCK外源基因的細(xì)菌表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21菌株中的高效表達(dá)，通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白完全以可溶性方式存在于細(xì)胞破碎上清液中。收集該上清液并進(jìn)而通過鎳柱親和層析，SCK重組蛋白純度可達(dá)>90%以上，利用Brandford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml。該蛋白表達(dá)和純化體系可為SCK轉(zhuǎn)基因植物蛋白檢測(cè)用抗體提供穩(wěn)定免疫性抗原，同時(shí)也可為蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供穩(wěn)定物質(zhì)基礎(chǔ)。

（作者單位： 518040 廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心）