沙仁高娃

核酸是生物體的基本組成物質(zhì)，是重要的生物大分子，從高等動(dòng)物，植物到簡單的病毒都含有核酸。核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩大類。RNA是基因表達(dá)中間產(chǎn)物，同時(shí)也是RNA病毒的遺傳物質(zhì)，對RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。RNA分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的基本技術(shù)，TRIZOL試劑法提取RNA既快速有高效，TRIZOL法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌從幾十毫克至幾克樣品中提取RNA。用TRIZOL法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。本實(shí)驗(yàn)對TRIZOL試劑法進(jìn)行改進(jìn)，目的在于獲得快速高效提取馬肝臟總RNA的方法，為有關(guān)馬肝臟RNA分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與試劑

1.1材料

馬肝臟

1.2主要試劑

無RNA酶滅菌水，氯仿，乙醇，TRIZOL試劑，液氮，DEPC水。

1.3主要儀器

冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，研缽，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，電泳儀，紫外光檢測儀，電泳槽。

1.4注意事項(xiàng)

1.4.1全程必須戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的提取并成為RNA酶的來源。

1.4.2使用滅菌的一次性塑料器皿避免使用公共儀器所導(dǎo)致RNA酶交叉污染。

1.4.3在TRZOL中RNA是隔離在RNA酶污染之外而對樣品的后續(xù)操作要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150度的轟響中烘烤4小時(shí)。

2.提取RNA

1.把0.1g肝臟剪碎放入研缽中加入少量液氮.迅速研磨，待組織變軟再加液氮，再研磨，這樣三次后室溫放置5分鐘將樣品轉(zhuǎn)到2.0ml的離心管中。

2.粉末溶化前加入1mlTRIZOL試劑.混勻。用力振蕩15/30s，平放離心管在冰板上5min。在4℃，12000g下離心10min。

3.取上清2ml離心管中，加入與上清等體積的氯仿，上下顛倒混勻。在4℃，12000g下離心10min。

4.取上清1.5ml離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min。在4℃，12000g下離心10min。

5.棄上清，加入1ml預(yù)冷的75%乙醇輕輕洗滌RNA沉淀。在4℃，12000g下離心1min。

6.棄上清，用槍頭吸去剩余液體，室溫干燥10-15min。加入適量的DEPCH2O溶解RNA。

7.在-70℃保存待用。

8.與TRIZOL試劑說明書相比，改進(jìn)部分為；第2步的離心為增加的一步；第3步抽提蛋白時(shí)氯仿使用量0.2ml增加到1ml；第4步異丙醇沉淀RNA及75%乙醇洗滌RNA沉淀時(shí)，試劑經(jīng)預(yù)熱。

3.RNA的完整性及質(zhì)量檢測

3.1RNA的電泳分析

RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在1×TAE中進(jìn)行，瓊脂糖濃度為1%，上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔，以5v/cm的電壓電泳1.5/2.0h，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察所提取RNA的完整性。

3.2RNA純度鑒定

開啟紫外分光光度計(jì)預(yù)熱穩(wěn)定30min再用DEPC處理水校正零點(diǎn)。取0.5ulRNA樣品用DEPC水稀釋100倍。將稀釋液轉(zhuǎn)到比色杯中讀取260nm。280nm處的紫外光吸收值。計(jì)算OD260/OD280用于純度分析。

4.結(jié)果

4.1RNA的純度檢測

用紫外光光分度計(jì)測的RNAA260。A280值（表1）；其A260/A280值1。7/2。0間，說明RNA純度較高。

4.2RNA的質(zhì)量檢測

取0.5ulRNA樣品進(jìn)行非變性瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果表明28S。18S和5SrRNA帶型清晰，從圖1中清晰的看到28S。18SrRNA兩條主帶，跑在最前面的5SrRNA也隱約可見。以上結(jié)果說明提取的總RNA純度較高，無明顯降解，符合實(shí)驗(yàn)要求（圖1）。

5.討論

本方法從提高RNA產(chǎn)率及減少TRIZOL降解入手。針對TRIZOL操作方法進(jìn)行優(yōu)化改良。與說明書提供的操作方法相比不同之處在于。

5.1 加入TRIZOL試劑用力振蕩后平放試管。使得RNA更易被抽提；異丙醇。無水乙醇沉淀RNA及75%乙醇洗RNA沉淀都經(jīng)預(yù)冷。增加RNA沉淀從而提高RNA產(chǎn)率；

5.2 增加了1次高速離心，能更為有效地除去不溶性的蛋白質(zhì)。多糖。多酚等大分子物質(zhì)；但減少了分離相離心時(shí)間（由15min減至10min）?？偺崛r(shí)間僅延長約5min。在提取RNA的過程中用有機(jī)溶劑沉淀RNA沉淀很多。復(fù)溶時(shí)大量沉淀不溶。本方法所提RNA溶解迅速，說明增加高速離心是一種簡單有效除去蛋白質(zhì)。多糖。多酚等大分子物質(zhì)的方法。此外。為了更徹底地去除多糖。多酚。也可在TRIZOL抽提后。離心前加入無水乙醇0.1/0.3ml（達(dá)到總體積的10%/30%），可增加多糖。多酚及DNA等大分子沉淀。而RNA仍溶解，從而提高RNA的純度。

5.3 在抽提蛋白質(zhì)時(shí)增加了氯仿使用量。由0.2ml增加到1ml能夠更為有效地去除蛋白質(zhì)。

（作者單位：011800內(nèi)蒙古烏蘭察布四子王旗草原工作站）