沙仁高娃
核酸是生物體的基本組成物質(zhì),是重要的生物大分子,從高等動物,植物到簡單的病毒都含有核酸。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類。RNA是基因表達(dá)中間產(chǎn)物,同時也是RNA病毒的遺傳物質(zhì),對RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)中占有重要地位。RNA分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)研究中的基本技術(shù),TRIZOL試劑法提取RNA既快速有高效,TRIZOL法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌從幾十毫克至幾克樣品中提取RNA。用TRIZOL法提取的總RNA無蛋白和DNA污染。本實驗對TRIZOL試劑法進(jìn)行改進(jìn),目的在于獲得快速高效提取馬肝臟總RNA的方法,為有關(guān)馬肝臟RNA分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
1.材料與試劑
1.1材料
馬肝臟
1.2主要試劑
無RNA酶滅菌水,氯仿,乙醇,TRIZOL試劑,液氮,DEPC水。
1.3主要儀器
冷凍臺式高速離心機,研缽,低溫冰箱,冷凍真空干燥器,電泳儀,紫外光檢測儀,電泳槽。
1.4注意事項
1.4.1全程必須戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌,可能污染RNA的提取并成為RNA酶的來源。
1.4.2使用滅菌的一次性塑料器皿避免使用公共儀器所導(dǎo)致RNA酶交叉污染。
1.4.3在TRZOL中RNA是隔離在RNA酶污染之外而對樣品的后續(xù)操作要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150度的轟響中烘烤4小時。
2.提取RNA
1.把0.1g肝臟剪碎放入研缽中加入少量液氮.迅速研磨,待組織變軟再加液氮,再研磨,這樣三次后室溫放置5分鐘將樣品轉(zhuǎn)到2.0ml的離心管中。
2.粉末溶化前加入1mlTRIZOL試劑.混勻。用力振蕩15/30s,平放離心管在冰板上5min。在4℃,12000g下離心10min。
3.取上清2ml離心管中,加入與上清等體積的氯仿,上下顛倒混勻。在4℃,12000g下離心10min。
4.取上清1.5ml離心管中,加入與上清等體積的異丙醇,混勻,室溫靜置10min。在4℃,12000g下離心10min。
5.棄上清,加入1ml預(yù)冷的75%乙醇輕輕洗滌RNA沉淀。在4℃,12000g下離心1min。
6.棄上清,用槍頭吸去剩余液體,室溫干燥10-15min。加入適量的DEPCH2O溶解RNA。
7.在-70℃保存待用。
8.與TRIZOL試劑說明書相比,改進(jìn)部分為;第2步的離心為增加的一步;第3步抽提蛋白時氯仿使用量0.2ml增加到1ml;第4步異丙醇沉淀RNA及75%乙醇洗滌RNA沉淀時,試劑經(jīng)預(yù)熱。
3.RNA的完整性及質(zhì)量檢測
3.1RNA的電泳分析
RNA的非變性瓊脂糖凝膠電泳在1×TAE中進(jìn)行,瓊脂糖濃度為1%,上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔,以5v/cm的電壓電泳1.5/2.0h,然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察所提取RNA的完整性。
3.2RNA純度鑒定
開啟紫外分光光度計預(yù)熱穩(wěn)定30min再用DEPC處理水校正零點。取0.5ulRNA樣品用DEPC水稀釋100倍。將稀釋液轉(zhuǎn)到比色杯中讀取260nm。280nm處的紫外光吸收值。計算OD260/OD280用于純度分析。
4.結(jié)果
4.1RNA的純度檢測
用紫外光光分度計測的RNAA260。A280值(表1);其A260/A280值1。7/2。0間,說明RNA純度較高。
4.2RNA的質(zhì)量檢測
取0.5ulRNA樣品進(jìn)行非變性瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果表明28S。18S和5SrRNA帶型清晰,從圖1中清晰的看到28S。18SrRNA兩條主帶,跑在最前面的5SrRNA也隱約可見。以上結(jié)果說明提取的總RNA純度較高,無明顯降解,符合實驗要求(圖1)。
5.討論
本方法從提高RNA產(chǎn)率及減少TRIZOL降解入手。針對TRIZOL操作方法進(jìn)行優(yōu)化改良。與說明書提供的操作方法相比不同之處在于。
5.1 加入TRIZOL試劑用力振蕩后平放試管。使得RNA更易被抽提;異丙醇。無水乙醇沉淀RNA及75%乙醇洗RNA沉淀都經(jīng)預(yù)冷。增加RNA沉淀從而提高RNA產(chǎn)率;
5.2 增加了1次高速離心,能更為有效地除去不溶性的蛋白質(zhì)。多糖。多酚等大分子物質(zhì);但減少了分離相離心時間(由15min減至10min)??偺崛r間僅延長約5min。在提取RNA的過程中用有機溶劑沉淀RNA沉淀很多。復(fù)溶時大量沉淀不溶。本方法所提RNA溶解迅速,說明增加高速離心是一種簡單有效除去蛋白質(zhì)。多糖。多酚等大分子物質(zhì)的方法。此外。為了更徹底地去除多糖。多酚。也可在TRIZOL抽提后。離心前加入無水乙醇0.1/0.3ml(達(dá)到總體積的10%/30%),可增加多糖。多酚及DNA等大分子沉淀。而RNA仍溶解,從而提高RNA的純度。
5.3 在抽提蛋白質(zhì)時增加了氯仿使用量。由0.2ml增加到1ml能夠更為有效地去除蛋白質(zhì)。
(作者單位:011800內(nèi)蒙古烏蘭察布四子王旗草原工作站)