吳海濤

摘要：目的：研究端粒酶mRNA轉(zhuǎn)染對于軟骨組織活性的提高作用。方法：選用大鼠的軟骨組織細(xì)胞，采用電染法實現(xiàn)端粒酶mRNA轉(zhuǎn)染，從而進行對照研究。結(jié)果：轉(zhuǎn)染后，軟骨組織細(xì)胞端粒酶活性增強，具有較強生長能力。結(jié)論：端粒酶mRNA轉(zhuǎn)染對于軟骨組織活性提高具有積極作用，具有進一步研究的價值。

關(guān)鍵字：端粒酶；軟骨組織；電轉(zhuǎn)染；活性提高作用；mRNA

前言

軟骨組織在人體中廣泛存在于骨組織的末端，是人體骨骼的主要保護組織，可使骨骼之間避免摩擦及沖擊。軟骨組織是由膠原組織、少許細(xì)胞、以及60-80%的水份等成份所構(gòu)成，成人的軟骨組織中并無神經(jīng)和血管，因此軟骨組織受傷后自行修復(fù)能力較差，容易在各種損傷作用下產(chǎn)生軟骨組織損傷，進而導(dǎo)致各種軟骨組織疾病的發(fā)生。

軟骨組織損傷性疾病是臨床多發(fā)疾病，自青壯年至老年 均可發(fā)病，發(fā)病率較高，是引起勞動力致殘的原因之一。軟骨組織損傷性疾病的治療有保守治療及手術(shù)治療，但目前治療均不能從根本上去除病患。多種因素均可導(dǎo)致軟骨組織損傷性疾病的發(fā)生，如創(chuàng)傷、遺傳等。軟骨組織細(xì)胞在維持軟骨組織生理功能中發(fā)揮重要作用，在軟骨損傷疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。軟骨組織細(xì)胞隨著年齡的增長，生物學(xué)功能逐漸減低。老年人群中軟骨組織損傷性疾病發(fā)病率非常高，這可能和老年患者軟骨組織細(xì)胞功能下降有關(guān)。目前已 有研究者探索軟骨損傷性疾病的細(xì)胞治療。

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由端 粒DNA和端粒蛋白質(zhì)組成，其功能是完成染色體末端的 復(fù)制，防止染色體融合、重組和降解[1-2]。在大多數(shù)正常 體細(xì)胞，由于所謂的“末端復(fù)制問題”，端粒隨每次細(xì)胞分裂而縮短。當(dāng)端?？s短到臨界長度時，即會造成細(xì)胞 靜止或凋亡，稱之為細(xì)胞衰老。但在生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì) 胞等永生化細(xì)胞中，一般通過一種細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄酶—— 端粒酶的作用，端粒的長度維持穩(wěn)定[3]，因此保證了這些 細(xì)胞的無限分裂。

端粒酶有3個組成部分：端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶催化亞基。端粒酶RNA是合成端粒的模板，也是相關(guān)蛋白的結(jié)合支架，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶是含有7個 基元的轉(zhuǎn)錄酶，表現(xiàn)聚合酶活性，在無細(xì)胞的情況下將 端粒酶RNA和人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶混合在一起即可表現(xiàn)端 粒酶活性，而端粒酶相關(guān)蛋白與端粒長度調(diào)節(jié)和端粒酶活性無關(guān)[4]。由于端粒酶RNA在細(xì)胞中大量存在。因此，端粒酶活性主要由人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶決定。許多研究者 利用外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因”[5-9]。

文章期望通過將外源性人端粒得多種細(xì)胞“永生化酶反轉(zhuǎn)錄酶基因介導(dǎo)入軟骨組織細(xì)胞中，從而增強軟骨組織細(xì)胞的生物學(xué)特性，延長其在體外的傳代時間及增殖能力，并保持細(xì)胞的細(xì)胞表型，即所謂的“永生化”。

材料與方法

設(shè)計：細(xì)胞學(xué)體外觀察實驗。

實驗材料：Wistar大鼠9只，雌雄不限，體質(zhì)180-200g。實驗過程中對動物處置方法符合動物倫理學(xué)要求。

實驗方法：

1、軟骨細(xì)胞的分離純化和鑒定

無菌環(huán)境下分離其脛骨及股骨，去除周圍附著的軟組織，并將干骺端與骨連接處2 mm的組織剪下，修整為1 mm×1 mm× 1 mm小塊，放入D-Hanks液中漂洗，用吸管將其移至 離心管中，1 000 r/min離心8 min，棄去上清，用胰酶重懸細(xì)胞，37 ℃水浴箱中消化5 min，再次離心，棄上清，加入0.1% Ⅰ型膠原酶重懸細(xì)胞后移至培養(yǎng)瓶中消化過夜，將消化液過濾去掉未消化的組織塊，離心，去上清，D-Hanks液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種至含體積分?jǐn)?shù)為 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中。

洗細(xì)胞2次，離心去上清，加入磁珠Buffer溶液重懸，加入羊抗兔IgG免疫磁珠10μL孵育，離心去上清，用磁珠 Buffer溶液清洗細(xì)胞2次，加入磁珠Buffer溶液重懸，將細(xì)胞懸液緩緩滴入位于磁場中的分離柱內(nèi)，待懸液緩緩?fù)ㄟ^分離柱后，用Buffer緩緩沖洗，將陰性細(xì)胞洗脫。移開磁場，用Buffer溶液快速沖洗分離柱，將FGFR-3陽性細(xì)胞洗脫，即為軟骨細(xì)胞。然后再次離心去上清，加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取部分做爬片，固定，用免疫組化法對其進行鑒定。

2、端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因電轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)24 h后取 對數(shù)生長期細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，PBS沖洗，胰酶消化，離心，收集前軟骨干細(xì)胞，加入電穿孔緩沖液使其重懸，離心800×g，靜置5 min，清洗細(xì)胞3次，離 心，重懸于電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)移至電擊杯，加入20 μg質(zhì)粒 DNA，輕輕混勻，靜置于冰上30 min，以電壓350 V/cm，電容25 μF，時間常數(shù)T為0.9 ms的電轉(zhuǎn)化參數(shù)進行電穿孔。將轉(zhuǎn)染后的前軟骨干細(xì)胞在室溫中放置30 min，移入DMEM培養(yǎng)基中放入37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒為陰性對照序列組，對照組未進行轉(zhuǎn)染。

3、TRAP-ELISA法檢測軟骨細(xì)胞端粒酶活性

采用Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit試劑盒按 說明書測定軟骨細(xì)胞端粒酶活性，在Ep管中加入 2×105 細(xì)胞，在4 ℃條件下按照3 000×g標(biāo)準(zhǔn)離心10 min，去除上清，加入200 μL Solution 1，依據(jù)16 000×g標(biāo)準(zhǔn) 離心20 min，吸取1-3 μL上清于一新的Ep管中，加入 25 μL Solution 2；取3 μL細(xì)胞提取物于85 ℃滅活10 min 作為陰性對照；在各管中加入Solution 6 使總體積至 50 μL；將樣本進行擴增，整體反應(yīng)溫度及時間為：25 ℃ 10 min →個循環(huán)94 ℃ 1 min→30（94 ℃30 s 30 s→50 ℃ →72 ℃；取 30 s）→72 ℃ 10 min PCR擴增產(chǎn)物5 μL進行 ELISA實驗，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值。

4、RT-PCR檢測端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNA的表達(dá)

按照Trizol試劑說明書中的具體步驟提取各組細(xì)胞的總RNA，以紫外分光光度計檢測樣品吸光度并計算純度及 濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)條件：95 ℃-94 5 min ℃-55 30 s ℃-72 40 s℃ 30 s，36個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。每一PCR反應(yīng)重復(fù) 3次。

將所得PCR產(chǎn)物在4 ℃條件下進行瓊脂糖凝膠電 泳，在凝膠自動成像儀上拍照提取圖像。以β-actin作為 內(nèi)參照。

5、CCK-8法檢測細(xì)胞生長情況

將各組細(xì)胞接種 在96孔板上，每孔100 μL，每組設(shè)3個平行孔，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄掉細(xì)胞培 養(yǎng)液，加入CCK-8 10 μL，于培養(yǎng)箱溫育2 h，在酶標(biāo)儀 上測定吸光度值。

6、生長曲線測定

將各組同一時期轉(zhuǎn)染前后的前 軟骨干細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔2.0×104 細(xì)胞密度 接種于24孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于37 ℃、體積分 數(shù)為5%CO2孵箱培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第2天起，每天同一時 間消化3個孔，進行精確計數(shù)，連續(xù)5 d后繪制各組細(xì)胞 的生長曲線。

結(jié)果

首先采用TRAP-ELISA檢測各組細(xì)胞端粒酶活性，結(jié)果顯示：與陰性對照序列 組和對照組相比，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染組細(xì)胞端粒 酶蛋白表達(dá)上調(diào)，陰性對照序列組和對照組細(xì)胞端粒 酶蛋白表達(dá)差異無顯著性意義（P > 0.05）。

轉(zhuǎn)染48 h后，與對照 組、陰性對照序列組相比較，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞的吸光度值顯著升高，差異有顯著性意義（P < 0.05）。與對照組、陰性對照 序列組相比較，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染組的S期細(xì)胞明 顯增多；與對照組、陰性對照序列組相比較，G1期細(xì)胞 在人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染組明顯減少，差異有顯著性意 義（P < 0.05），M期細(xì)胞無明顯變化。

與對照組、陰性對照序列組比較，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染組軟骨細(xì)胞的增殖能力顯著增強，差異有顯著性意義（P<0.05）。

討論

軟骨組織疾病的成因主要由于軟骨組織在損傷后的修復(fù)能力缺失，因此可以將提高軟骨組織活性作為軟骨組織疾病的治療方向加以研究。端粒酶既能夠延長端粒的末端，使其壽命得以增長，又能夠維持其長度[10-11]正常人體細(xì)胞中不能檢測出端粒酶活性的表達(dá)[12-13]，其表達(dá) 的多少主要決定因素是人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶[14-16]。近年來的 研究發(fā)現(xiàn)，正常人體中人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)受到抑 制，且其表達(dá)是調(diào)控人端粒酶活性的重要因素[17-19]。

人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染 對其在軟骨細(xì)胞的表達(dá)有明顯促進作用，并且不影響 其他亞單位的表達(dá)，與有關(guān)研究結(jié)果一致[14-19]。在對照組、陰性對照序列組中，人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶 mRNA 表現(xiàn)為陰性，啟動子未被激活。在轉(zhuǎn)染組中前軟骨干細(xì)胞啟動子的 活性、mRNA表達(dá)處在較高水平[20-22]，使端粒酶活性增加，端粒長度得以保持，延緩衰老。同時該研究亦證實人端粒 酶反轉(zhuǎn)錄酶可以加速軟骨細(xì)胞的增殖，誘使其發(fā)生永生化，與以往相關(guān)文獻(xiàn)研究相符合[23-25]。

綜上所述，將人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，可以明顯提高端粒酶活性，S 期細(xì)胞明顯增多。因此，可通過人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染來促進軟骨細(xì)胞增殖，進而達(dá)到治療軟骨損傷的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1] Campisi J，Sahn-Ho K，Chang-Su L，et al. Cellular senescence，cancer and aging；the telomere connection.Exp Gerontol. 2001；36：1619.

[2] Greider CW. Telomere length regulation. Annu Rev Biochem. 1996；65：337. [5] Blackburn EH. Telomere states and cell fates. Nature. 2000；408（6808）：53-56.

[3] Yan P，Bosman FT，Benhattar J. Tissue quanlity is an important determinant of telomerase activity as measured by TRAP assay. Biotechniques. 1998；25（4）：660-662.

[4] Wieser M，Stadler G，Jennings P，et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. Am J Physiol Renal Physiol. 2008；295（5）：F1365-1375.

[5] Lee KM，Choi KH，Ouellette MM. Use of exogenous hTERT to immortalize primary human cells. Cytotechnology. 2004；45（1-2）：33-38.

[6] Gao K，Lu YR，Wei LL，et al. Immortalization of mesenchymal stem cells from bone marrow of rhesus monkey by transfection with human telomerase reverse transcriptase gene. Transplant Proc. 2008；40（2）：634-637.

[7] Chung SA，Wei AQ，Connor DE，et al. Nucleus pulposus cellular longevity by telomerase gene therapy，Spine. 2007；32（11）：1188-1196.

[8] Matsumura T，Takesue M，Westerman KA，et al. Establishment of an immortalized human-liver endothelial cell line with SV40T and hTERT. Transplantation. 2004；77（9）：1357-1365.

[9] Wei LL，Gao K，Liu PQ，et al. Mesenchymal stem cells from Chinese Guizhou minipig by hTERT gene transfection，Transplant Proc. 2008；40（2）：547-550.

[10] Abdallah BM，Haack-S?rensen M，Burns JS，et al. Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite [corrected] extensive proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2005；326（3）：527-538.

[11] 邢瑩，秦潔，曹孟德，等. 細(xì)胞因子誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì) 胞分化過程中細(xì)胞巢蛋白、神經(jīng)絲亞單位和端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶mRNA的表達(dá)[J].鄭州大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，40（2）：250-253. [12] Autexier C，Lue NF. The structure and function of telomerase reverse transcriptase. Annu Rev Biochem. 2006；75：493-517.

[13] 唐峰，顧棟樺，王虹，等.端粒酶hTERT mRNA表達(dá)在乳腺 癌進展中的意義及其與p53的相關(guān)性[J].中華腫瘤雜志，2006，28（3）：192-195.

[14] 張潔，廖亞平，吳靈芝，等.hTERT基因轉(zhuǎn)染對人胚胎皮層 神經(jīng)元生長的影響[J].解剖學(xué)研究，2008，30（4）：251-256.

[15] Xu L，Li S，Stohr BA. The role of telomere biology in cancer. Annu Rev Pathol. 2013；8：49-78. [16] 吳靈芝，李水彬，程剛衛(wèi)，等. hTERT基因轉(zhuǎn)染對人神經(jīng)元 活力的影響[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，34（2）：170-173.

[17] Harley CB.Telomerase and cancer therapeutics.Nat Rev Cancer. 2008；8（3）：167-179.

[18] 靳斌，王偉，劉澤陽，等.外源hTERT基因轉(zhuǎn)染對老年大鼠 供肝缺血再灌注損傷的防護作用[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué) 版，2013，51（8）：13-16.

[19] Park YJ，Kim EK，Moon S，et al. Human telomerase reverse transcriptase is a promising target for cancer inhibition in squamous cell carcinomas.Anticancer Res. 2014；34（11）：6389-6395.

[20] 劉云燕，裘秀春，張殿忠，等. hTERT反義寡核苷酸對脊索 瘤細(xì)胞周期及增殖的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19（10）：1922-1924.

[21] 張曉輝，張建寧，康春生，等.hTERT正、反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗 研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜 志，2006，5（3）：217-221.

[22] 張志宏，曾永秋，稅青林，等. hTERT-siRNA表達(dá)載體的構(gòu) 建及對MCF-7細(xì)胞生長、端粒酶活性的抑制作用[J].解放 軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（6）：561-564.

[23] 李宏良，曾榮香，陳鵬，等. 清毒片和hTERT反義核酸對 HL-60細(xì)胞增殖及凋亡的協(xié)同作用[J].遼寧中醫(yī)雜志，2010，37（3）：395-398.

[24] Abdallah BM，Haack-S?rensen M，Burns JS，et al. Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchymal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene despite [corrected] extensive proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2005；326（3）：527-538.

[25] 王開利，遲淑萍，孫杰，等.外源hTERT基因?qū)θ烁渭?xì)胞增 殖及CYP45019A1表達(dá)的影響[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2011，32（11）：1137-1138.