陳亞威 張業(yè)鵬 范志勇

摘要 [目的]探討液相色譜-同位素質(zhì)譜法（LC-IRMS）技術(shù)在蜂蜜摻假鑒定中的應(yīng)用效果。[方法]采用LC-IRMS法檢測(cè)隨機(jī)抽樣的62個(gè)蜂蜜樣品，對(duì)蜂蜜中果糖（Fru）、葡萄糖（Glu）、二糖和三糖δ13C值進(jìn)行測(cè)定。[結(jié)果]由于真實(shí)蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值與最小值的差值小于2.1‰，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）為-1‰ ～1‰，且不得含有寡糖，所以該次檢測(cè)樣品中有48.38%的蜂蜜不合格，摻假摻雜以添加C-3 植物源轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和淀粉糖漿為主，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這類摻假的監(jiān)控管理。[結(jié)論] LC-IRMS實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中各種糖組分如果糖、葡萄糖、二糖和三糖等δ13C的分離與分析，可進(jìn)行添加了C-3糖漿的摻假鑒定，大大提高了蜂蜜摻假的檢測(cè)能力。

關(guān)鍵詞 液相色譜-同位素質(zhì)譜；蜂蜜；摻假；δ13C值

中圖分類號(hào) S896.1；TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）07-0009-02

Identification of Honey Adulteration by Liquid Chromatography-isotope Mass Spectrometry （LC-IRMS）

CHEN Ya-wei1，2， ZHANG Ye-peng1，2， FAN Zhi-yong2，3

（1.School of Mechanical Engineering， Hubei University of Technology， Wuhan， Hubei 430068；2.Key Lab of Modern Manufacture Quality Engineering， Wuhan， Hubei 430068；3.Hubei Provincial Institute for Food Supervision and Test， Wuhan， Hubei 430068）

Abstract [Objective] The aim was to explore application of LC-IRMS technique in identification of honey adulteration. [Method] We detected 62 honey samples by LC-IRMS， and determined δ13C value of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey. [Result] The difference of maximum and minimum δ13C of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of true honey was less than 2.1‰， and δ13CFru - δ13CGlu was from -1‰ to 1‰， and there was no oligosaccharides， so 48.38% of samples was no qualified. The adulteration was mainly C-3 plant products and starch syrup， so the monitoring management of adulteration should be strengthened. [Conclusion] LC-IRMS realizes the δ13C isolation and analysis of fructose， glucose， disaccharide and trisaccharide of honey， so it can be used in the adulteration identification of C-3 syrup and can improve the detection capability of honey adulteration.

Key words Liquid chromatography-isotope mass spectrometry （LC-IRMS）；Honey；Adulteration；δ13C value

蜂蜜是一種高品質(zhì)的天然甜味劑，是由蜜蜂從花蜜或蜜露中生產(chǎn)出來的。蜂蜜主要含葡萄糖、果糖和蔗糖，還含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸及多種維生素和礦物質(zhì)等，特別含有多種活性酶類，如淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、過氧化氫酶和脂酶等。因此，蜂蜜是一種富有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的天然食品[1]。近年來隨著人民生活品質(zhì)的提高，蜂蜜在國(guó)內(nèi)外需求量不斷增大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)蜂蜜每年的銷量遠(yuǎn)大于產(chǎn)量，蜂蜜摻假摻雜行為確實(shí)存在，尤以內(nèi)銷蜂蜜更為嚴(yán)重，且呈不斷加重趨勢(shì)。蜂蜜真實(shí)性鑒別成為當(dāng)前急需解決的技術(shù)問題。

目前，測(cè)定蜂蜜摻假的主要方法有液相色譜示差折光檢測(cè)法、薄層色譜法（TLC法）、糖類指紋圖譜法、元素分析同位素比值質(zhì)譜法和離子色譜法等[2]。對(duì)于目前市面上的摻假手段，如在蜂蜜中加入C-3或C-4植物糖漿，上述方法總有些局限性，耗時(shí)長(zhǎng)、干擾多、靈敏度不高。

利用穩(wěn)定同位素技術(shù)鑒定蜂蜜摻假問題越來越得到商檢質(zhì)檢等檢測(cè)機(jī)構(gòu)的關(guān)注。隨著穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，以及連續(xù)流在線裝置的集成化、多功能化和多樣化，穩(wěn)定同位素分析結(jié)果成為快速評(píng)鑒蜂蜜是否摻假的有力證據(jù)。液相色譜-同位素質(zhì)譜法（LC-IRMS）采用液相色譜分離蜂蜜中的糖，測(cè)定蜂蜜中各種糖組分的δ13C值，測(cè)定結(jié)果與純正蜂蜜中各糖組分的δ13C值做對(duì)比，用來鑒別蜂蜜的真假，提高了試驗(yàn)效率和靈敏度。筆者采用LC-IRMS對(duì)62個(gè)蜂蜜樣品進(jìn)行了檢測(cè)，旨在為蜂蜜摻假監(jiān)控與管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。

DELTA V Advantage同位素質(zhì)譜儀（Thermo Fisher公司）；UltiMate3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher公司）與Isolink接口；Phenomenex Rezek RCM（Ca2+）色譜柱（300 mm × 8 mm，Thermo Fisher公司）；0.45 μm 水相濾膜。

1.1.2 試劑。

4% Na2S2O8溶液和4% H3PO4溶液；超純水（Millipore公司）；He（高純99.999%，載氣）；CO2（工作標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)猓?；蔗糖?biāo)準(zhǔn)品；δ13C標(biāo)準(zhǔn)品（Caffeine）水溶液。

1.1.3 樣品。蜂蜜樣品：來自日常抽檢樣品（共62個(gè)樣）。

1.2 樣品處理

稱取0.5 g蜂蜜樣品，用超純水溶解，定容至50 mL，過0.45 μm水相濾膜到進(jìn)樣瓶中供液相色譜-同位素質(zhì)譜儀測(cè)定。

同一蜂蜜樣品分別配制成1、10 g/L蜂蜜稀釋液，用于蜂蜜中果糖/葡萄糖δ13C和二糖/三糖δ13C的測(cè)定。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件。

色譜柱為Phenomenex Rezek RCM（Ca2+），洗脫劑為100%超純水，流速為30 μL/min，樣品溶液進(jìn)樣體積為10 μL，柱箱溫度為70 ℃。Acid Pump（H3PO4）和Ox.-Pump（Na2S2O8）流速均控制在40 μL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件。

氧化爐溫度99.9 ℃；離子源：電子轟擊離子源；轟擊電壓120.8 eV；掃描方式：正離子掃描；輔助氣壓力0.4 MPa；離子源電壓2.97 kV；真空度2.0×10-4 Pa。進(jìn)樣品測(cè)定時(shí)，每個(gè)樣品的分析起始階段和尾氣階段通入CO2參考?xì)膺M(jìn)行系統(tǒng)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。如果m/z 44信號(hào)在1～2 V或更低，則CO2的本底測(cè)試通過[3]。如果m/z 32信號(hào)在8～12 V，則O2的本底測(cè)試通過。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-同位素質(zhì)譜法分析蜂蜜樣品中各類糖組分的δ13C值

如果蜂蜜是單一花種的純正蜂蜜，其中含有果糖、葡萄糖、二糖和三糖的碳同位素值應(yīng)十分接近。根據(jù)Elflein等[4]和Simsek等[5]的研究報(bào)道，真實(shí)純蜂蜜樣品各類糖組分的δ13C值在-28.2‰～-22.5‰，葡糖糖和果糖的δ13C值的差值為±1‰，果糖、葡萄糖、二糖和三糖的δ13C的最大值與最小值的差值小于2.1‰，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）為-1‰～1‰。

由表1可知，果糖葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不在-1‰～1‰的有5、6、7、47號(hào)等9個(gè)樣品，其中δ13C差值最小為2.4‰，最大為3.5‰，屬于有摻假樣品，這9個(gè)有摻假的樣品經(jīng)過其他方法提取時(shí)發(fā)現(xiàn)屬于無蛋白或超低蛋白樣品，由此判定若蜂蜜中無蛋白，那這種蜂蜜極可能為假蜂蜜。而蜂蜜中各種糖組分最大值與最小值的差值（δ13CMax - δ13CMin） < 2.1‰的有12、14、17、44、56等22個(gè)樣品，也屬于摻假樣品，其中差值最大的達(dá)7.99‰，在這些樣品中，還有15、17、18、44這4個(gè)樣品檢測(cè)出寡糖，而真實(shí)蜂蜜中是不得檢出寡糖的[6]，所以這些樣品都存在摻假摻雜。結(jié)果顯示，檢測(cè)樣品中共有30個(gè)摻假樣品，占62份蜂蜜樣品總數(shù)的48.38%，并且凡是樣品蜂蜜中果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）不合格的，各種糖組分的差值（δ13CMax - δ13CMin）也不合格；但蜂蜜中各種糖組分的差值（δ13CMax - δ13CMin）不合格的，果糖、葡萄糖的δ13C差值（δ13CFru - δ13CGlu）可能合格，也可能不合格[7]。說明目前的摻假手段大多是針對(duì)二糖、三糖甚至寡糖的摻假，也就是直接加入了C-3植物源糖漿來?yè)郊佟?/p>

2.2 LC-IRMS法在蜂蜜摻假中的檢測(cè)應(yīng)用

圖1為使用LC-IRMS方法測(cè)定蜂蜜中各種糖組分的δ13C的離子流強(qiáng)度-時(shí)間圖譜。蜂蜜試樣中的各種糖組分經(jīng)過HPLC在線分離和LC IsoLink濕化學(xué)氧化，轉(zhuǎn)化為CO2，分別進(jìn)行同位素比質(zhì)譜分析，在譜圖上均顯示為尖峰。譜圖上顯示純正蜂蜜中三糖在1 000 s附近出峰，二糖在1 100 s附近出峰，葡萄糖在1 300 s附近出峰，果糖在1 700 s附近出峰。

應(yīng)用該方法檢測(cè)來自7個(gè)不同企業(yè)共計(jì)62個(gè)抽檢樣品（生產(chǎn)日期在2015年12月至2016年6月）中，共有30個(gè)樣品不合格，摻假占總數(shù)的48.38%；而利用已有的高效液相示差法分析蜂蜜中還原糖及蔗糖含量，結(jié)果顯示只有3個(gè)樣品不合格，占樣品總數(shù)的4.84%；利用薄層色譜法（TLC法）測(cè)定蜂蜜中的高果淀粉糖漿，結(jié)果顯示有16個(gè)樣品不合格，占樣品總數(shù)的25.81%。說明應(yīng)用LC-IRMS法在蜂蜜中的摻假檢出率遠(yuǎn)高于原有的方法。且這些企業(yè)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有提出申訴異議，說明該方法準(zhǔn)確有效。

2.3 LC-IRMS法測(cè)定精度

在每次檢測(cè)蜂蜜樣品同時(shí)測(cè)定蜂蜜平行樣品，測(cè)定62個(gè)蜂蜜平行樣品各種糖組分的δ13C值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表2可知，LC-IRMS方法測(cè)定蜂蜜中各種糖組分δ13C值標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1‰～0.4‰。二糖和三糖標(biāo)準(zhǔn)偏差比果糖、葡萄糖高些，是由于二糖和三糖在蜂蜜中含量相當(dāng)?shù)?，所以要?0 g/L蜂蜜稀釋液進(jìn)行測(cè)定，而果糖、葡萄糖的含量相對(duì)高些，所以用1 g/L蜂蜜稀釋液進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)溫度、濕度、色譜分離效果、系統(tǒng)不穩(wěn)定等因素也

存在造成偏差增大的可能性[8]。對(duì)于日常蜂蜜分析，LC-IRMS法完全可以滿足蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值的測(cè)定。

3 結(jié)論

利用LC-IRMS法來檢測(cè)隨機(jī)抽樣的62個(gè)蜂蜜樣品，對(duì)蜂蜜中果糖、葡萄糖、二糖和三糖δ13C值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30份存在摻假摻雜，占總數(shù)的48.38%。摻假手段大多是針對(duì)C-3植物源的葡萄糖、果葡萄糖漿甚至多種物質(zhì)混合摻假，更具隱蔽性，同時(shí)突出該方法的優(yōu)越性和準(zhǔn)確性。摻假蜂蜜在市場(chǎng)上大量存在，形式多樣，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控和管理。

參考文獻(xiàn)

[1] 費(fèi)曉慶，吳斌，沈崇鈺，等.液相色譜/元素分析 同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定蜂蜜摻假[J].色譜，2011，29（1）：15-19.

[2] 中華人民共和國(guó)秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局.蜂蜜中碳-4 植物糖含量測(cè)定方法穩(wěn)定碳同位素比率法：GB/T 18932.1—2002[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[3] 丁濤.液相色譜-同位素質(zhì)譜聯(lián)用法在蜂蜜摻假鑒定方面的應(yīng)用[C]//第四屆華東地區(qū)色譜、質(zhì)譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)論文集.無錫：江蘇省分析測(cè)試協(xié)會(huì)，2010.

[4] ELFLEIN L，RAEZKE K P.Improved detection of honey adulteration by measuring differences between 13C/12C stable carbon isotope ratios of protein and sugar compounds with a combination of elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry and liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry （δ13C-EA/LC-IRMS）[J].Apidologie，2008，39（5）：574-587.

[5] SIMSEK A，BILSEL M，GREN A C.13C/12C pattern of honey from Turkey and determination of adulteration in commercially available honey samples using EA-IRMS[J].Food chemistry，2012，130（4）：1115-1121.

[6] PADOVAN G J，DE JONG D，RODRIGUES L P，et al.Detection of adulteration of commercial honey samples by the 13C/12C isotopic ratio[J].Food chemistry，2003，82（4）：633-636.

[7] 黃文誠(chéng).用不同的方法檢測(cè)高果糖玉米糖漿摻假的蜂蜜[J].中國(guó)蜂業(yè)，2009，60（9）：51-52.

[8] 羅東輝，羅海英，冼燕萍，等.同位素質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別無蛋白蜂蜜的真實(shí)性[J].現(xiàn)代食品科技，2012，28（7）：862-866.