馬小琴，王曉敏，周凡

（新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司，新疆烏魯木齊830011）

大孔吸附樹脂法分離純化葡萄籽中原花青素

馬小琴，王曉敏，周凡*

（新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司，新疆烏魯木齊830011）

研究大孔吸附樹脂法純化分離原花青素的工藝條件及參數(shù)。采用香草醛-硫酸方法進行分光光度法測定，考察AB-8大孔樹脂對原花青素的吸附率、吸附量、解吸附率、純度。結(jié)果表明：上樣液中原花青素含量在4.5 mg/mL～6.5 mg/mL范圍較為合適，當(dāng)AB-8樹脂與提取液的比例為1∶10（g/mL），上樣流速為1.5 BV/h，吸附時間為8 h時，吸附率達到95%以上；以40%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫劑用量為6 BV，解析率為99%，此條件下得到的固體純度為94.7%，用AB-8型大孔樹脂分離，純化原花青素的方法可行。

大孔樹脂；葡萄籽；原花青素；純化

葡萄籽中含有大量原花青素，原花青素是由單體黃烷-3-醇以不同聚合度鏈接而成的多酚類化合物[1]，研究表明，原花青素?fù)碛酗@著的抗氧化和改善微循環(huán)功能，此外還具有護肝解毒、降血壓、降血脂、消炎、抗癌、治療心血管疾病等功效[2-3]，廣泛應(yīng)用于保健品、化妝品、食品等行業(yè)。

AB-8大孔吸附樹脂具有再生簡便、解析條件溫和、使用周期長、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點，是一種性能良好的原花青素吸附劑[4]。本文擬采用乙醇超聲波輔助提取葡萄籽原花青素，研究AB-8大孔樹脂對葡萄籽中原花青素提取液的純化技術(shù)，考察最佳上樣量、最佳上樣濃度、最佳上洋流速、最佳洗脫劑及用量等對純化效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

葡萄籽：新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司。

AB-8型大孔吸附樹脂：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；原花青素標(biāo)品（純度為98%）：北京盈澤納新化工技術(shù)研究院提供；氫氧化鈉、甲醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、硫酸：西安化學(xué)試劑廠；無水乙醇：天津市百世化工有限公司；香草醛：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DW型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；R-1010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TU-1950紫外-可見分光光度儀：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；十萬分之一分析天平：余姚市金諾天平儀器有限公司；SHZ-82A水浴恒溫震蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品9.49 mg，用無水乙醇溶解并定容至10 mL配成標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用移液管分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，配制濃度分別為0.047 45、0.094 90、0.118 75、0.142 35、0.189 8、0.237 5、0.287 5 mg/mL原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，依次加入3%香草醛-甲醇溶液5 mL；30%硫酸-甲醇溶液5 mL；混合均勻后在水浴鍋中恒溫（30℃）避光反映15 min。以3%香草醛-甲醇溶液：30%硫酸-甲醇溶液：無水乙醇=5∶5∶1的混合溶液為空白對照，在502 nm波長處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，用二元回歸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為

Y=2.107 5X+0.006 4，R2=0.999 9

式中：Y是吸光度值；X是原花青素濃度，mg/mL。

1.2.2 葡萄籽原花青素的提取工藝

精確稱取脫脂干燥并過2號篩的葡萄籽提取物適量，加入10倍量50%乙醇溶液，提取溫度為60℃，置200 W超聲水浴中回流提取40 min，提取2次，過濾、合并濾液，減壓回收至無醇味，得葡萄籽原花青素濃縮液。然后選用AB-8型大孔樹脂進一步純化。

1.2.3 AB-8樹脂對葡萄籽提取液中原花青素的吸附試驗

1.2.3.1 AB-8型大孔吸附樹脂的預(yù)處理

將AB-8用蒸餾水浸泡充分溶脹，再用5%HCl和2%NaOH酸堿重復(fù)處理2次后，然后用蒸餾水洗至中性。用95%乙醇浸泡12 h充分溶脹，濾去水及浮游物和破碎樹脂后洗至澄清，再用NaOH（0.5 mol/L）浸泡8 h～10 h并不時攪拌，除去堿液水至中性，再經(jīng)HCl（0.5 mol/L）浸泡8 h～10 h并不時攪拌以除去新樹脂中的各種雜質(zhì)，除去酸液水洗至中性，再用70%乙醇浸泡4 h～6 h并不時攪拌，除去溶劑后繼續(xù)用70%乙醇洗至洗出液滴入水中不呈現(xiàn)乳白色渾濁為止，最后用蒸餾水洗去溶劑。

1.2.3.2 AB-8大孔樹脂對葡萄籽提取液中原花青素靜態(tài)吸附試驗

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的AB-8型樹脂適量，置于250 mL錐形瓶中，精密加入葡萄籽提液液50 mL，置于恒溫?fù)u床中，25℃下振蕩24 h，每隔一段時間進行取樣一次，測其原花青素含量，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)特征曲線。測定濾液的原花青素含量，并計算AB-8樹脂對葡萄籽原花青素靜態(tài)吸附量、吸附率。

吸附量/（mg/g）=（樣品原花青素總量-吸附后濾液中原花青素總量）/樹脂的重量

吸附率/%=（樣液原花青素總量-吸附后濾液中原花青素總量）/樣液原花青素總量×100

1.2.3.3 AB-8大孔樹脂對葡萄籽提取液中原花青素動態(tài)吸附試驗方法

量取葡萄籽提取物溶液適量，分別緩慢地加入裝有AB-8樹脂的層析柱中，控制流速分別為1、1.5、2.0、2.5 BV/h，收集流分，測定不同流速的原花青素含量。吸附飽和后的樹脂用不同乙醇對其進行洗脫，收集洗脫液，依次測定原花青素含量，計算原花青素動態(tài)飽和吸附率、解析率和純度。

解析率/%=洗脫液中原花青素的總量/（樣品原花青素總量-吸附后濾液中原花青素總量）×100

純度/%=產(chǎn)物中原花青素的質(zhì)量/產(chǎn)物的質(zhì)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8樹脂對葡萄籽提取液中原花青素靜態(tài)吸附效果

2.1.1 AB-8樹脂的用量對靜態(tài)吸附作用的影響

AB-8樹脂與提取液按不同的比例混合，分析樹脂對原花青素的吸附效果，樹脂用量對靜態(tài)吸附作用的影響如圖1所示。

圖1 樹脂用量對靜態(tài)吸附作用的影響Fig.1 The effect of resin dosage on static absorption

由圖1結(jié)果表明，樹脂與提取液的比值為1∶10（g/ mL）時，對原花青素是吸附率最高（95.58%）；當(dāng)樹脂與提取液的比值在1∶35（g/mL）后，其吸附量基本無變化，達到平衡；本因素試驗，以吸附率為考察指標(biāo)，最終確定樹脂與提取液的比值為1∶10（g/mL）。

2.1.2 提取液中原花青素濃度對吸附作用的影響

用不同原花青素含量的提取液進行靜態(tài)吸附試驗，提取液原花青素濃度對靜態(tài)吸附效果的影響如圖2所示。

圖2 提取液原花青素濃度對靜態(tài)吸附效果的影響Fig.2 The effect of procyanidins concentration on static absorption efficiency

由圖2可知，提取液的原花青素含量在4.0mg/mL～6.5 mg/mL時，吸附率較大且相近；提取液中原花青素含量在8 mg/mL時吸附量較高，但此時吸附率很低；因此綜合考慮，以吸附率與吸附量為指標(biāo)，最終確定上樣液濃度為4.5 mg/mL～6.5 mg/mL。

2.1.3 作用時間對靜態(tài)吸附作用的影響

AB-8樹脂對葡萄籽原花青素的靜態(tài)吸附進程如圖3所示。

圖3 AB-8樹脂對葡萄籽原花青素的靜態(tài)吸附進程Fig.3 The static absorption progress of AB-8 resin on procyanidins in grape seeds

由圖3結(jié)果可知，樹脂對葡萄籽原花青素的靜態(tài)吸附時（AB-8樹脂與提取液以1∶10（g/mL）的比例），在0～24 h內(nèi)，隨著時間的增加，樹脂的吸附率與吸附量顯著增加，在0～2 h內(nèi)增加速度最快，當(dāng)吸附時間達到8 h時，吸附率為72.95%、吸附量為103.104 mg/mL，隨后樹脂對原花青素的吸附效果變化不大。因此，確定一般為8 h。

2.2 AB-8樹脂對葡萄籽提取液中原花青素動態(tài)吸附效果

2.2.1 流速對動態(tài)吸附作用的影響

上樣流速是影響大孔樹脂吸附效率的關(guān)鍵因素，若上樣速度過快，會使得原花青素吸附量減少，導(dǎo)致原花青素樣品的浪費；若上樣流速太慢，雖然可以使大孔樹脂充分吸附原花青素，但是耗時較長，影響效率。上樣流速對葡萄籽原花青素吸附效果的影響如圖4所示。

圖4 上樣流速對葡萄籽原花青素吸附效果的影響Fig.4 The effect of flow rate on procyanidins absorption

由圖4可知，上樣速度越慢，大孔樹脂吸附率和吸附量越大；上樣流速達到2 BV/h后，吸附率與吸附量明顯下降，上樣液在1.0 BV/h～1.5 BV/h間，吸附率與吸附量差別不大，考慮到時間成本，最終確定上樣流速為1.5 BV/h。

2.2.2 洗脫液的濃度對動態(tài)洗脫效果的影響

采用不同濃度的乙醇溶液對吸附于樹脂上的原花青素進行洗脫，確定洗脫液。不同濃度乙醇溶液的解吸效果如圖5所示。

圖5 不同濃度乙醇溶液的解吸效果Fig.5 The desorption of different concentration alcohol

圖5結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的升高，解吸率與純度均有一個先上升后下降的趨勢。孫蕓等研究認(rèn)為，低濃度乙醇（低于40%）可洗脫原花青素的單體及低聚體（有活性部分），40%以上的乙醇可洗脫原花青素的高聚體[6]。同時，乙醇濃度越高，解吸液雜質(zhì)含量也越多，純度越低。因此綜合考慮樹脂解吸率、洗脫原花青素的種類及純度，選擇40%乙醇作為葡萄籽原花青素的解吸劑。

2.2.3 洗脫時的動態(tài)解吸分析

用40%乙醇溶液對吸附于樹脂上的原花青素進行洗脫，分段對流出液進行分析，測定洗脫率。動態(tài)解吸附曲線如圖6所示。

圖6 動態(tài)解吸附曲線Fig.6 The dynamic desorption curve

圖6結(jié)果表明，通過第1個100 mL時，原花青素開始被洗脫下來，然后在第2個100 mL迅速達到高峰；在第9個100 mL后，吸附在樹脂上的原花青素就被完全洗脫下來，并且曲線出峰很快，無明顯拖尾。最終換算成柱體積后，則40%乙醇溶液的使用量為6 BV。

2.3 驗證試驗

為了確認(rèn)純化條件組合生產(chǎn)條件的再現(xiàn)性，進行了驗證試驗。將預(yù)處理的AB-8型樹脂100 g，進行濕法裝柱，分別加入葡萄籽提取物溶液，樹脂與提取液比例為1∶10（g/mL），以1.5 BV/h的流速進行動態(tài)吸附，純化水洗至洗脫液中不含有原花青素，棄去流出液。最后以40%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫劑用量為6 BV進行解吸附。洗脫下的溶液進行濃縮，烘干。稱其固體含量，計算純度，結(jié)果見表1。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，上樣液中原花青素含量在4.5 mg/mL～6.5 mg/mL范圍較為合適，當(dāng)AB-8樹脂與提取液的比例為1∶10（g/mL），上樣流速為1.5 BV/h，吸附時間為8 h時，吸附率達到99%以上；以40%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫劑用量為6 BV時，解析率為98%，此條件下得到的固體純度為94.7%，說明用AB-8型大孔樹脂純化葡萄籽中原花青素的結(jié)果可行。

表1 驗證試驗結(jié)果Table 1 Results of confirmatory experiment

[1]王璐,鄭茂強,王猛,等.葡萄籽原花青素的分離純化研究[J].糧食與食品工業(yè),2009,16(1)：26-28

[2]趙文恩,韓桂花,焦鳳云.葡萄籽原花青素提取工藝研究[J].食品科學(xué),2002,23(8)：108-110

[3]張瑜,張換換,李志洲,等.紅毛丹果皮中原花青素提取及其抗氧化活性研究[J].食品研究與開發(fā),2011,32(1)：188-192

[4]丁利君.AB-8樹脂對半邊旗提取液中黃酮的吸附作用[J].食品科學(xué),2007,28(10)：241-244

[5]孫蕓,徐寶才,谷文英,等.AB-8樹脂對葡萄籽原花青素按聚合度分離特性的研究[J].食品科技,2007(6)：60-63

Separation and Purification of Procyanidins in Grape Seed with Macroporous Adsorption Resin

MA Xiao-qin，WANG Xiao-min，ZHOU Fan*
（Xinjiang Hua Shidan Pharmaceutical Reaearch Co.，Ltd.，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

To optimize the technical parameters of optimize the technical parameters of procyanidins separation and purification with macroporous resin.The vanillin-sulfuric acid spectrophotometry was used to investigate adsorption rate，adsorbtion capacity，eluting rate and purity of procyanidin.The results indicated that the optimum ranges of procyanidin in sample solution was 4.5 mg/mL to 6.5 mg/mL.The rate of AB-8 resin and reagent was 1∶10（g/mL），the flow rate was 1.5 BV/h and the adsorbtion time was 8 h，the adsorbtion capacity of procyanidin was more than 95%.The eluting rate of procyanidin and the purity of solid were 99%and 94.7%，respectively，by using 40%ethyl alcohol as eluent with 6 BV of dosage.The macroporous adsorption resin method is reliable and can be applied for separation and purification of procyanidin.

macroporous resin；grape seed；procyanidins；purification

2016-10-21

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才（2015BC001）作者簡介：馬小琴（1988—），女（回），助理工程師，學(xué)士，主要從事藥物制劑研究。

*通信作者：周凡（1984—），女（漢），工程師，碩士，主要從事藥物制劑研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.012