尹小平 黎尉浩 朱棟良 嚴(yán)海冬 王芳元

·論著·

結(jié)、直腸腫瘤腸道菌群特異性的臨床研究

尹小平 黎尉浩 朱棟良 嚴(yán)海冬 王芳元

目的 研究腸道菌群變化與結(jié)、直腸腫瘤之間的關(guān)系。方法 病理檢查證實(shí)的結(jié)、直腸腫瘤患者35例為研究組，同期結(jié)腸鏡檢查排除結(jié)、直腸腫瘤的患者35例為對照組。收集兩組患者的糞便標(biāo)本，采用擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)技術(shù)對樣本內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行檢測，比較兩組菌種的變化及規(guī)律。結(jié)果 兩組70例樣本共檢出389 010條高質(zhì)量序列，研究組和對照組Chao1指數(shù)分別為1.01×103和0．85×103，Shannon指數(shù)分別為0．11×102和0．14×102，兩組菌群多樣性和均勻性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而在菌種/屬水平，有15種細(xì)菌豐度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)直腸腫瘤患者腸道某些菌種與正常人存在差異，研究其變化規(guī)律有可能實(shí)現(xiàn)對結(jié)、直腸腫瘤進(jìn)行早期的預(yù)防、早期診斷，并為微生態(tài)制劑作為結(jié)、直腸腫瘤的治療方式提供依據(jù)。

腸道菌群； 結(jié)直腸腫瘤

流行病學(xué)研究顯示，結(jié)、直腸腫瘤發(fā)病有一定的家族聚集現(xiàn)象，20.0%的結(jié)、直腸腫瘤發(fā)病中遺傳因素起重要作用，但>70.0%的發(fā)病與環(huán)境因素有關(guān)[1]。各種腫瘤相關(guān)基因，如原癌基因存在但不被活化，在環(huán)境等外因作用下，經(jīng)過表觀遺傳修飾變化引起該基因活化。人體腸道菌群是結(jié)、直腸腫瘤的主要環(huán)境因素，宿主腸道菌群變化與結(jié)、直腸腫瘤的關(guān)系逐漸取代基因成為結(jié)直腸腫瘤研究的重點(diǎn)[2]。我們應(yīng)用擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)技術(shù)，對結(jié)、直腸腫瘤患者和正常群體的腸道菌群進(jìn)行比較，尋求兩者之間的差異性和潛在的規(guī)律性。

對象與方法

一、對象

實(shí)驗(yàn)組35例，為2015年1月以來結(jié)腸鏡下取材行病理檢查證實(shí)為結(jié)、直腸腫瘤患者，男16例，女19例，平均年齡53.4歲；其中升結(jié)腸8例，橫結(jié)腸6例，降結(jié)腸8例，乙狀結(jié)腸5例，直腸8例。對照組35例，為同期結(jié)腸鏡檢查排除結(jié)、直腸腫瘤的患者。兩組患者年齡40～60歲，排除結(jié)、直腸腫瘤復(fù)發(fā)或經(jīng)過放化療患者；排除合并腸梗阻、腸穿孔、腸炎、糖尿病、嚴(yán)重全身性疾病；所有對象1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素，2個(gè)月內(nèi)未使用非甾體抗炎藥或益生菌類藥物。

二、方法

1.行腸道準(zhǔn)備前1天留取新鮮糞便樣本1 g，分別懸于9 ml PBS磷酸鹽緩沖液中，渦旋至樣品充分混勻。4℃ 200 g離心5分鐘，收集上清液，此過程重復(fù)3次。離心3分鐘，收集菌體。最后用PBS磷酸鹽緩沖液洗3次，無菌水洗1次，將菌體分裝為每管1 ml。

2.樣本細(xì)菌基因組DNA提取及純化：每個(gè)樣品取15 ml洗液收集于離心管中。25℃條件下4000 g離心5分鐘收集含菌沉淀物。采用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒從上述沉淀物中提取細(xì)菌基因組DNA，并使用瓊脂糖凝膠電泳分析基因組質(zhì)量。制備的細(xì)菌基因組DNA置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.16S rDNA克隆及純化：使用通用引物F27(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)和R1492(5′-ggttaccttgttacga- ctt-3′)對基因組DNA進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增。這對引物具有很強(qiáng)的通用性，可擴(kuò)增出絕大多數(shù)細(xì)菌的16S rRNA基因片段(長度>1．4 kb)。50 μl PCR反應(yīng)體系中包含如下成分：基因組DNA(0．1 Ug/μl)2 μl，2 mmol/L dNTPs 5 μl，10 PCR buffer 5 μl，引物(F27和R1492)各10 pmol，TaqPlus DNA聚合酶(Tap+Pfu，Sangon)l U。反應(yīng)程序如下：94℃ 5分鐘后，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)。最后72℃ 8分鐘。瓊脂糖凝膠電泳后，使用E.Z.N.ATME膠純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。使用TA克隆試劑盒將獲得的PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建16 rDNA文庫，使用藍(lán)一白篩選獲得陽性克隆。

圖1 部分樣本DNA電泳圖 圖2 部分樣本優(yōu)勢菌種PCR擴(kuò)增16S rRNA基因電泳圖

4.ARDRA分析及序列分析：隨機(jī)選擇白色重組子克隆再次進(jìn)行PCR。本輪PCR的引物對采用載體上的T7(5′-taatacgactcactataggg-3′)和SP6(5′-catacgatttaggtgacactatag-3′)。50 μl PCR反應(yīng)體系中包含如下成分：質(zhì)粒DNA，10×PCRbuffer 5 μl，2 mmol/L dNTPs 5 μl，引物(T7和SP6)各10 pmol，TaqPlusDNA聚合酶(Tap+Pfu，Sangon)1U。反應(yīng)程序如下：94℃ 5分鐘，進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 8分鐘。將所得產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增性核糖體DNA分析。其中采用Hin6 1和Msp I(MBI)雙酶切割，酶切后1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析OTUs。按照允許2個(gè)不匹配的差異進(jìn)行預(yù)聚類，以平均鄰近法聚類(97%的相似度)獲得運(yùn)算的分類單位(operationaltaxonomic units，OTUs)數(shù)量。隨后將優(yōu)勢OTUs進(jìn)行測序。所得16S rRNA基因序列用BLAST程序在美國生物技術(shù)信息中心序列數(shù)據(jù)庫基因序列進(jìn)行比對。比對中遵循的基本原則是：如果2種細(xì)菌的16S rRNA基因序列存在97%以上的相似性，可以視為同一種細(xì)菌[3]。

5.數(shù)據(jù)分析：將每個(gè)分類單位內(nèi)所含的序列標(biāo)簽數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))和菌群多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))代表菌群相對豐度，計(jì)算公式如下：Schao1=So+F12/2(F2+1)-F1F2/2(F2+1)2，其中So為觀測到的OTU數(shù)量，F(xiàn)1為只有一條系列的的OTU數(shù)量，F(xiàn)2為有二條系列的的OTU數(shù)量；Sshannon=∑i=1fi/nlnfi/n，fi為含有i條系列的的OTU數(shù)量，n為系列數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用方差分析和t檢驗(yàn)判斷細(xì)菌種系差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

部分樣本基因組DNA電泳圖見圖1。兩組70例樣本共檢出389 010條高質(zhì)量序列，平均每份樣本5557條?；?7%的OTUs相似度，平均每個(gè)樣本得到98個(gè)OUTs，研究組和對照組Chao1指數(shù)分別為1.01×103和0．85×103，Shannon指數(shù)分別為0．11×102和0．14×102，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組樣本優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌屬、乳酸菌桿菌屬、C.leptum菌屬、雙歧桿菌屬、C.coccoides菌屬和腸桿菌屬。部分樣本優(yōu)勢菌電泳圖見圖2。

基于菌種/屬水平，研究組和對照組糞便菌群有15種菌種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究組枸櫞酸桿菌屬、擬桿菌屬、消化鏈球菌屬、埃希桿菌屬、鏈球菌屬、紫單胞菌屬、梭菌屬、梭形桿菌屬及腸球菌屬與對照組比較明顯升高，而普氏菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、酸酐菌屬、真桿菌屬、變形桿菌屬與對照組比較明顯降低，見表1。

表1 研究組與對照組菌種/屬豐度均值對照

討 論

結(jié)、直腸腫瘤是一種常見消化道腫瘤，隨著我國人民生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[4-5]。結(jié)、直腸腫瘤的主要癌前病變已經(jīng)確定，異常隱窩-腺瘤-結(jié)直腸腫瘤發(fā)生途徑中的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制已經(jīng)得到廣泛的研究。腸道內(nèi)菌群與宿主存在著緊密的共生關(guān)系，腸道菌群可促進(jìn)人體免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟，參與形成腸道黏膜屏障，防止病原菌定制，還可以解毒腸道致癌因子[6]。一旦正常的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生失衡，則會(huì)引起代謝改變，進(jìn)而引發(fā)疾病。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)、直腸腫瘤患者與健康人比較，總的腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，然而多樣性降低。Scanlan等[8]的研究結(jié)果則顯示，結(jié)、直腸腫瘤患者與健康人相比腸道菌群穩(wěn)定性下降、多樣性增加。

目前主流學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，腸道內(nèi)微生物引起的局部及全身慢性炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制[9]。革蘭陰性細(xì)菌水平過高可以增加腸道通透性，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥、肥胖及炎性腸病相關(guān)的炎癥反應(yīng)[10]。炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子及趨化因子，包括腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素17、白介素-23等，可以促進(jìn)血管形成、抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，研究組腸道菌群在菌群結(jié)構(gòu)及菌群多樣性上無明顯差別?？梢娊Y(jié)、直腸腫瘤患者腸道菌群的改變并不是益生菌的絕對消失或有害菌的絕對增長，而是相對的改變。其中枸櫞酸桿菌屬、消化鏈球菌屬、埃希桿菌屬、鏈球菌屬、擬桿菌屬、紫單胞菌屬、梭菌屬、梭形桿菌屬及腸球菌屬較對照組明顯升高，而普氏菌屬、羅氏菌屬、瘤胃球菌屬、酸酐菌屬、真桿菌屬、變形桿菌屬較對照組明顯降低。多數(shù)研究認(rèn)為，結(jié)、直腸腫瘤的發(fā)生與梭菌及擬桿菌的增加有關(guān)，脆弱類桿菌及產(chǎn)氣莢膜菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸活性明顯高于其他細(xì)菌，該酶可以將腸道內(nèi)無毒性物質(zhì)水解、游離、活化，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸拘晕镔|(zhì)，增加腸道致癌物質(zhì)的含量[11]。而產(chǎn)丁酸鹽菌種對于腸道健康具有重要的意義，可以為腸黏膜細(xì)胞呼吸提供能量，保持腸道上皮細(xì)胞完整性，調(diào)整腸道免疫應(yīng)答[12]。產(chǎn)丁酸鹽菌種的降低而羅氏菌是產(chǎn)丁酸鹽的代表菌種。

腸道菌群的結(jié)構(gòu)失衡與結(jié)、直腸腫瘤的發(fā)生相關(guān)，特別是擬桿菌屬及產(chǎn)丁酸鹽菌種結(jié)構(gòu)的變化可能是結(jié)、直腸腫瘤發(fā)生的警示。通過對相關(guān)腸道菌種的結(jié)構(gòu)優(yōu)化可能將有助于降低結(jié)、直腸腫瘤的發(fā)生。

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(本文編輯：楊澤平)

Clinical study on the specificity of intestinal flora in colorectal cancer

YINXiaoping，LIWeihao，ZHUDongliang，etal.

(DepartmentofGastrointestinalSurgeryⅡ，XianningCenterHospital，Xianning437100，China)

Objective To study the relationship of microbial community structure in the intestine with colorectal cancer.Methods 70 patients were choosen randomly and divided into two groups on average，the control group and research group.The research group was who were diagnosed as colorectal cancer by colonoscopy and pathology,the control group was who were excluded as colorectal cancer.We collected their stool samples，and detect the bacteria in it by Amplified ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA).Then comparedand analyze their difference.Results 389 010 high quality sequences were detected in 70 samples.The Chao1 index and Shannon index of the control group were 0．85×103and 0.14×102,the research group were 1.01×103and 0．11×102.There was no significant difference between the two groups on these indexs(P>0.05).But 15 bacterial genera were underrepresented or overrepresented in the research group′s stool samples(P<0.05).Conclusion There was a significant difference between some strains of colorectal cancer patients and the normal.It is possible to study the change law and realize the early prevention，early diagnosis and early diagnosis of colorectal cancer，and provide the basis for microbial preparation as the treatment of colorectal cancer.

intestinal flora； colorectal cancer

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.07.014

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014CFC1085)

437100 湖北省咸寧市中心醫(yī)院/同濟(jì)咸寧醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科二病區(qū)

2016-09-29)