沈俊炳

(詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所，福建 詔安 363500)

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毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)魚露中的L-羥脯氨酸含量

沈俊炳*

(詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所，福建 詔安 363500)

毛細(xì)管電泳；電化學(xué)發(fā)光；吡啶釕；L-羥脯氨酸；魚露

L-羥脯氨酸(L-Hydroxyproline)，化學(xué)名為反-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline)，分子式為C5H9NO3，分子量為131.13，是一種亞氨基酸。L-羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸[1]，占正常膠原蛋白氨基酸總數(shù)的10%以上，但在其他普通蛋白質(zhì)中含量極少[2]，因此被作為動(dòng)物水解蛋白的指示性氨基酸[3]。通過檢測(cè)食品中的L-羥脯氨酸含量的多少，就可以判定食品的加工過程中是否違法添加了動(dòng)物水解蛋白以提高食品中的蛋白質(zhì)含量[4-7]。魚露是中國(guó)沿海地區(qū)及東南亞各國(guó)人民喜愛的傳統(tǒng)調(diào)味料。它是利用低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚蝦及水產(chǎn)加工的下腳料發(fā)酵制成的。傳統(tǒng)工藝中魚露發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致有部分不法生產(chǎn)者利用動(dòng)物水解蛋白液配制魚露，謀取暴利。通過檢測(cè)魚露中的L-羥脯氨酸含量并計(jì)算其占總氨基酸含量的比例，鑒別魚露的真?zhèn)危哂兄匾默F(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及檢測(cè)樣品同參考文獻(xiàn)[16]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)池條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)電位

圖1 檢測(cè)電位對(duì)ECL強(qiáng)度的影響(n=5)光電倍增管電壓：800 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣條件：10 kV × 10 s；運(yùn)行電壓：15 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.1 Effects of detection potential on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Ru(bpy: 5 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS); Injection parameters: 10kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00PBS;L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

圖濃度對(duì)ECL強(qiáng)度的影響(n=5)光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS；進(jìn)樣條件：10 kV × 10 s；運(yùn)行電壓：15 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50mg·L-1。Fig.2 Effects of Ru(bpy concentration on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy dissolved in 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; Injection parameters: 10 kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50mg·L-1.

圖3 緩沖溶液pH對(duì)ECL強(qiáng)度的影響(n=5)光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1PBS)；進(jìn)樣條件：10 kV × 10 s；運(yùn)行電壓：15 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.3 Effects of phosphate buffer pH in detection cell on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters: 10 kV×10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.2 進(jìn)樣條件的優(yōu)化

毛細(xì)管電泳常見的進(jìn)樣方式為電遷移進(jìn)樣模式和流體力學(xué)進(jìn)樣模式兩種，本研究使用的毛細(xì)管內(nèi)徑小，故采用電遷移進(jìn)樣模式。在電遷移進(jìn)樣模式中，進(jìn)樣量受到進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間的雙重影響。為此，本研究采用固定進(jìn)樣電壓或者進(jìn)樣時(shí)間，改變另一個(gè)進(jìn)樣參數(shù)來研究進(jìn)樣電壓或者進(jìn)樣時(shí)間對(duì)L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度和分離效率的影響，同時(shí)還需結(jié)合信噪比及峰型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。其中分離效率采用色譜分離理論中的理論塔板數(shù)來衡量。

在最佳檢測(cè)池條件下，保持其他參數(shù)如2.1.1中所述，先固定進(jìn)樣時(shí)間改變進(jìn)樣電壓進(jìn)樣電壓，研究其對(duì)L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4(A)所示；后在最佳進(jìn)樣電壓下，改變進(jìn)樣時(shí)間，研究其對(duì)L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4(B)所示。由圖4(A)可以看出，ECL強(qiáng)度剛開始隨著進(jìn)樣電壓的升高而明顯增強(qiáng)，到一定峰值后反而下降(線a)，這是由于進(jìn)樣電壓的升高使得同一時(shí)間進(jìn)入毛細(xì)管的樣品量增多而導(dǎo)致的，但是由于一次性進(jìn)入毛細(xì)管的樣品量過多反而會(huì)減弱ECL強(qiáng)度；同時(shí)過多的樣品量還會(huì)導(dǎo)致分離效率的下降，可以看出理論塔板數(shù)隨著進(jìn)樣電壓的升高而明顯下降(線b)。由圖4(B)可以看出，ECL強(qiáng)度也是隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加先增強(qiáng)后減弱，而理論塔板數(shù)隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加而明顯下降。綜合考慮，為了獲得較強(qiáng)的ECL強(qiáng)度和較好的分離效率，選擇10 kV × 12 s作為L(zhǎng)-羥脯氨酸的最佳進(jìn)樣條件。

2.3 運(yùn)行條件的優(yōu)化

2.3.1 運(yùn)行電壓

運(yùn)行電壓對(duì)分離效率、遷移時(shí)間及L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度有顯著影響。在最佳檢測(cè)池條件及最佳進(jìn)樣條件下，保持其他參數(shù)如2.1.1中所述，改變運(yùn)行電壓研究其對(duì)L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖5所示，運(yùn)行電壓由12 kV升高到16 kV，遷移時(shí)間不斷縮短，ECL強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。遷移時(shí)間縮短是由于運(yùn)行電壓的升高，電泳流和電滲流加大所導(dǎo)致；而ECL強(qiáng)度的增強(qiáng)則是由于短時(shí)間內(nèi)大量L-羥脯氨酸進(jìn)入檢測(cè)池所致。但是運(yùn)行電壓超過14 kV后，由于毛細(xì)管焦耳熱的產(chǎn)生，導(dǎo)致基線噪聲巨大。故綜合考慮焦耳熱、噪聲、靈敏度及分析時(shí)間，選擇14 kV作為最佳運(yùn)行電壓。

圖4 進(jìn)樣電壓(A)和進(jìn)樣時(shí)間(B)對(duì)ECL強(qiáng)度(a)和理論塔板數(shù)(b)的影響(n=5)(A)中光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣時(shí)間：10 s；運(yùn)行電壓：15 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。B中光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣電壓：10 kV；運(yùn)行電壓：15 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.4 Effects of injection voltage(A) and injection time(B) on ECL intensity(a) and theoretical plates(b)(A) PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection time: 10 s; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.(B)PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1 (dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection voltage: 10 kV; Running voltage: 15 kV; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

圖5 運(yùn)行電壓對(duì)ECL強(qiáng)度(a)和遷移時(shí)間(b)的影響(n=5)光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；(溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣條件：10 kV × 12 s；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1 pH8.00的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.5 Effects of running voltage on ECL intensity(a)and migration times(b)PMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters: 10 kV×12 s; Running buffer solution: 50 mmol·L-1 pH8.00 PBS;L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.3.2 運(yùn)行緩沖溶液的pH

2.3.3 運(yùn)行緩沖溶液濃度

運(yùn)行緩沖溶液濃度同樣對(duì)L-羥脯氨酸的ECL強(qiáng)度有較大影響。在最佳檢測(cè)池條件、最佳進(jìn)樣條件、最佳運(yùn)行電壓及最佳運(yùn)行緩沖溶液pH下，保持其他參數(shù)如2.1.1中所述，改變運(yùn)行緩沖溶液濃度研究其對(duì)L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)運(yùn)行緩沖溶液濃度從30 mmol/L增加到50 mmol/L時(shí)，ECL強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，并在50 mmol/L達(dá)到最大值；繼續(xù)增加運(yùn)行緩沖溶液濃度，ECL強(qiáng)度不增反而減弱。因此，選擇50 mmol/L作為最佳運(yùn)行緩沖溶液濃度。

圖6 運(yùn)行緩沖溶液pH對(duì)ECL強(qiáng)度的影響(n=5)光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；(溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣條件：10 kV × 12 s；運(yùn)行電壓：14 kV；運(yùn)行緩沖溶液：50 mmol·L-1的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.6 Effects of running buffer pH on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy 6 mmol·L-1(dissolved in 50 mmol·L-1 PBS); Injection parameters:10 kV×12 s; Running voltage: 14 kV; Running buffer solution:50 mmol·L-1 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

圖7 運(yùn)行緩沖溶液濃度對(duì)ECL強(qiáng)度的影響光電倍增管電壓：800 V；檢測(cè)電位：1.20 V；溶解于50 mmol·L-1 pH 8.00的PBS)；進(jìn)樣條件：10 kV × 12 s；運(yùn)行電壓：14 kV；運(yùn)行緩沖溶液：pH8.50的PBS；L-羥脯氨酸：50 mg·L-1。Fig.7 Effects of running buffer concentration on ECL intensityPMT voltage: 800 V; Detection potential: 1.20 V; Ru(bpy: 6 mmol·L-1 (dissolved in 50 mmol·L-1 pH 8.00 PBS); Injection parameters: 10 kV×12 s; Running voltage: 14 kV; Running buffer solution:pH8.50 PBS; L-Hydroxyproline: 50 mg·L-1.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和檢出限

2.5 樣品測(cè)定

按1.2中所述對(duì)魚露進(jìn)行稀釋制得2倍魚露稀釋液，取4份2倍魚露稀釋液，其中1份為待測(cè)液，其余3份分別添加10、20、30mg/L的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)。在最佳檢測(cè)條件下用L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液驗(yàn)證儀器達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)后，對(duì)魚露樣品進(jìn)行測(cè)定。L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品電泳圖如圖8(A)，魚露樣品電泳圖如圖8(B)。

由圖8可以看出，魚露中的其他組分不影響L-羥脯氨酸的測(cè)定，根據(jù)遷移時(shí)間可以推斷為圖8中箭頭所指的峰位即為L(zhǎng)-羥脯氨酸。通過回收率實(shí)驗(yàn)可以得出加入L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品后對(duì)應(yīng)的L-羥脯氨酸ECL強(qiáng)度有相應(yīng)增強(qiáng)，由此可見，能夠直接應(yīng)用CE-ECL法進(jìn)行魚露中的L-羥脯氨酸的測(cè)定。對(duì)2倍魚露稀釋液進(jìn)行5次平行測(cè)定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出魚露中的L-羥脯氨酸含量為50.44 mg/L；同時(shí)對(duì)添加10、 20、30mg/L的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的2倍魚露稀釋液進(jìn)行5次平行測(cè)定，其遷移時(shí)間和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表1(n=5)。在不同的5日內(nèi)對(duì)同一2倍魚露稀釋液進(jìn)行測(cè)定，其5日內(nèi)的日間遷移時(shí)間和峰高的RSD分別為0.43%和0.57%。

添加10、 20、30 mg/L的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的2倍魚露稀釋液的回收率見表2。

由此可見，CE-ECL法測(cè)定魚露中的L-羥脯氨酸的重現(xiàn)性及回收率均在可以接受的誤差范圍內(nèi)，效果良好。

3 結(jié)論

本研究將CE-ECL成功地應(yīng)用于魚露中的L-羥脯氨酸含量檢測(cè)。在最佳條件下，魚露中L-羥脯氨酸含量的檢出限為2.26 mg/L，線性范圍10～500 mg/L，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。CE-ECL法只需要15 min左右即可完成試樣的分析。因此，CE-ECL法對(duì)魚露中的L-羥脯氨酸含量的檢測(cè)具有高效快速等優(yōu)點(diǎn)，也可以為檢測(cè)水產(chǎn)品及其制品中的其他氨基酸的檢測(cè)提供良好的技術(shù)參考，在水產(chǎn)品及其制品中中的其他氨基酸檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖8 L-羥脯氨酸的CE-ECL圖(A)和魚露的CE-ECL圖(B)Fig.8 Electropherograms of L-Hydroxyproline (A) and fish sauce (B)

表1 遷移時(shí)間和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

Tab.1 Migration time and peak value of RSD %, n=5

表2 魚露中L-羥脯氨酸含量及其加標(biāo)后的回收率Tab.2 Content of L-Hydroxyproline in fish sauce and recovery rates of spiked samples

注：—示無(wú)。

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Determination of L-Hydroxyproline content in Fish Sauce by CapillaryElectrophoresis coupled with Electrochemiluminescence

SHEN Junbing*

(Zhao’an Institute of Quality Inspection and Metrological Verification, Zhao’an 363500, China)

SHEN Junbing, cysjbsjb@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.008

2017-01-17；接收日期：2017-03-26

詔安縣質(zhì)量計(jì)量檢驗(yàn)檢測(cè)所事業(yè)發(fā)展基金〔2016〕004號(hào)

沈俊炳(1989-)，男，碩士，工程師，研究方向?yàn)槭称房勺匪蒹w系和食品檢驗(yàn)技術(shù)及質(zhì)量控制，cysjbsjb@163.com

S91

A

2095-1833(2017)03-0052-07