楊金蘭，陳俊*，陳成桐，關(guān)歆，劉秀芬，陳嘉勛

(1.廣州市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州 510235;2.中國廣州分析測(cè)試中心廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定水產(chǎn)飼料中甲基睪丸酮的含量

楊金蘭1，陳俊1*，陳成桐1，關(guān)歆1，劉秀芬1，陳嘉勛2

(1.廣州市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州 510235;2.中國廣州分析測(cè)試中心廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

建立了水產(chǎn)飼料中甲基睪丸酮的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。具體優(yōu)化了檢測(cè)過程中提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、固相萃取柱、洗脫液濃縮方式、質(zhì)譜條件和流動(dòng)相組成等對(duì)加標(biāo)回收率有影響的主要因素。樣品經(jīng)40%甲醇水提取，提取液經(jīng)C18固相萃取柱凈化，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。甲基睪丸酮的質(zhì)量濃度在0.50～10.00 μg/L線性良好，該方法的檢出限為2.00 μg/kg，定量限為5.00 μg/kg。本方法適用于大批量飼料中的甲基睪丸酮的快速檢測(cè)。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(3):38-43]

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；飼料；甲基睪丸酮；檢測(cè)

甲基睪丸酮(methyltestosterone，簡稱MET)俗稱甲基睪丸素，屬于雄性激素類。由于它對(duì)魚類具有促生長、雄性化和增加產(chǎn)量等作用[1]，一些不法商家在魚飼料中摻入MET，以實(shí)現(xiàn)魚體的雄性化，達(dá)到增加產(chǎn)量目的。相關(guān)研究[2-5]表明，MET在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝時(shí)間較長，痕量殘留都會(huì)打亂人體激素平衡，導(dǎo)致生理功能紊亂，同時(shí)對(duì)新生兒也會(huì)產(chǎn)生畸形、黃疸及溶血等癥狀，因此，美國等多個(gè)國家都禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用MET。中國農(nóng)業(yè)部在2002年頒布的235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[6]規(guī)定禁止使用甲基睪丸酮并且動(dòng)物性食品中不得檢出。

目前，魚體中甲基睪丸酮的檢測(cè)研究方法報(bào)道較多，無論是液相色譜法[7-8]，還是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]，甚至酶聯(lián)免疫法[11]都很成熟。而對(duì)飼料中甲基睪丸酮的檢測(cè)方法研究卻報(bào)道很少，只有國家標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]和地方標(biāo)準(zhǔn)方法高效液相色譜法[13]。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的飼料來說，雜峰非常多，采用液相色譜法來分析，目標(biāo)峰很容易受到干擾，且檢出限高，前處理繁瑣。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測(cè)限低、前處理簡單，定性科學(xué)、定量準(zhǔn)確。因此，本研究在國家標(biāo)準(zhǔn)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的基礎(chǔ)上對(duì)提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、固相萃取柱類型、洗脫液濃縮方式、流動(dòng)相、色譜和質(zhì)譜條件等因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種檢出限低、前處理簡單、回收率高的檢測(cè)水產(chǎn)飼料中甲基睪丸酮的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法快速、準(zhǔn)確，且能滿足飼料中甲基睪丸酮大批量樣本的快速分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，Waters-Oasis HLB 固相萃取柱(60 mg，3 mL)，Supelco-C18固相萃取柱(60 mg，3 mL)，UPLC-MS/MS(島津LC20ADXR-AB SCIEX Triple Quad 5500)，以及超聲清洗器、粉碎機(jī)、離心機(jī)、旋渦振蕩器、電子天平、Milli Q去離子水發(fā)生器等。

供試飼料為羅非魚配合飼料，來源于江門市澳華特種水產(chǎn)公司。甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，甲醇為色譜純，水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用甲醇溶解MET標(biāo)準(zhǔn)品配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成不同質(zhì)量濃度的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將羅非魚配合飼料用粉碎機(jī)碾成粉末狀，準(zhǔn)確稱取(5.00±0.05)g樣品，置于100 mL離心管中，準(zhǔn)確加入40%甲醇水50.00 mL，加塞，充分搖動(dòng)1 min，再置超聲水浴提取10 min，其間充分搖動(dòng)兩次。取出后于8 000 r/min離心5 min。

1.2.2 凈化

分別用3 mL甲醇、3 mL水活化C18固相萃取柱，準(zhǔn)確取上清液5.00 mL上柱，在沒加壓的情況下，讓其自然流下，再用3 mL水和3 mL 5%甲醇溶液洗滌固相萃取柱，抽至近干，在不抽真空情況下，加入2 mL甲醇，收集洗脫液，甲醇定容至2 mL。渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，然后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 測(cè)定

1.2.3.1 液相色譜條件

流動(dòng)相A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫見表1。設(shè)定流速為0.3 mL/min，柱溫為30.0 ℃，進(jìn)樣量為10.0 μL，采集時(shí)間為6 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表Tab.1 Gradient elution of mobile phase

注：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液。

1.2.3.2 質(zhì)譜離子源條件

電噴霧(ESI)離子源下采用正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，其他參數(shù)詳見表2。

1.2.3.3 定性定量測(cè)定

取適量樣品制備液和相應(yīng)濃度的MET標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，以保留時(shí)間和二級(jí)離子m/z109、97進(jìn)行定性。定性方法：試樣保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)偏差不大于15%，分別計(jì)算樣品與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中非定量離子對(duì)與定量離子對(duì)色譜峰面積的比值，僅當(dāng)兩者數(shù)值的相對(duì)偏差不大于20%。定量方法：以二級(jí)子離子m/z97作為定量子離子，以峰面積比較進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校正定量。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Parameters of mass spectrometry

注：甲基睪丸酮(m/z)的定量離子對(duì)為303/97，定性離子對(duì)為303/109。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液體積分?jǐn)?shù)的選擇

取空白飼料樣品5.00 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.00、10.00、20.00、40.00和50.00 μg/kg的MET標(biāo)準(zhǔn)液，混勻放置0.5 h后，加入50.00 mL不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液，然后測(cè)定各樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。由結(jié)果可看出，當(dāng)甲醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，樣品中的MET能充分被提取，回收率在80.1%以上，能滿足日常檢測(cè)樣品回收要求，且干擾峰較少。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為20%～30%時(shí)，樣品回收率低，可能是甲醇含量低，對(duì)樣品中的MET提取效果不高。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)大于50%時(shí)，樣品回收率也隨著甲醇含量的升高而降低，同時(shí)干擾峰明顯增加很多?？赡茉蛴袃煞矫妫皇请S著甲醇水體積分?jǐn)?shù)增高，雜質(zhì)溶于甲醇水也增多，所以雜峰增多；二是過柱時(shí)，由于甲醇水體積分?jǐn)?shù)增高，樣品沒能很好吸咐在C18柱上，而是直接被洗脫出來，所以回收率也相應(yīng)降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇水作為提取液。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水對(duì)加標(biāo)平均回收率的影響Tab.3 Effect of different volume fraction of methanol and water solutions on average recovery

2.2 超聲提取時(shí)間的選擇

取空白飼料樣品5.0 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20.00、40.00和80.00 μg/kg的MET標(biāo)準(zhǔn)液，混勻放置0.5 h后，加入提取液，采用不同的超聲時(shí)間，按上述前處理操作，然后測(cè)定各樣品，結(jié)果見圖1。從圖1可看出，各樣品在超聲10 min后，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加標(biāo)濃度的回收率己趨于持平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間越久，雜峰越多，可能超聲時(shí)間長，對(duì)飼料里的雜質(zhì)提取得越多，因此，本實(shí)驗(yàn)選用10 min超聲時(shí)間。

圖1 不同提取時(shí)間對(duì)回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction time on recovery rate

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取法是目前MET殘留檢測(cè)主要使用的凈化方法[14-15]，主要是利用官能團(tuán)之間的作用力來分離目標(biāo)物和基質(zhì)干擾物，并最終洗脫出待測(cè)分析物。

根據(jù)MET的化學(xué)性質(zhì)，選擇了HLB和C18柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表4。C18柱的回收率(80.2%以上)較HLB柱(57.9%以上)高，且該柱選擇性較HLB柱好，雜峰較少，HLB柱保留雜質(zhì)較多，影響低質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品的測(cè)定。故本實(shí)驗(yàn)選用C18柱作為凈化柱。

2.4 洗脫液濃縮方式的選擇

國標(biāo)方法采用了洗脫2 mL，濃縮蒸干再定容的方法，而本研究選擇了直接洗脫上機(jī)，不濃縮蒸干，其兩者的回收率基本沒差別，但直接洗脫上機(jī)的方式不僅可以節(jié)省時(shí)間還可以減少損失。其次，本研究還發(fā)現(xiàn)，用2 mL洗脫液能將MET完全洗脫出來。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵進(jìn)樣模式，在ESI+電離模式下質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)，所以選擇了ESI+作為電離模式，確定電離模式后，再優(yōu)化質(zhì)譜離子源參數(shù)。選取氣簾氣(CUR) 25、30、35、40 MPa，電噴霧電壓5 000、5 300、5 500 V，離子源溫度(TEM) 500、550、600、650 ℃，霧化氣(GS1) 50、55、60、65 kPa，輔助氣(GS2) 50、55、60、65 kPa等進(jìn)行優(yōu)化，最后得出質(zhì)譜離子源最佳參數(shù)：氣簾氣(CUR)為40 MPa，電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度(TEM)為500 ℃，霧化氣(GS1)為55 kPa，輔助氣(GS2)為55 kPa。甲基睪丸酮的碎片選擇離子質(zhì)譜圖見圖2。

表4 兩種凈化萃取柱平均回收率比較Tab.4 Comparison of two kinds of extraction column on average recovery

圖2 MET碎片選擇離子質(zhì)譜圖Fig.2 Ion chromatogram of MET

2.6 流動(dòng)相組成的確定

流動(dòng)相的組成影響著MET的峰形、保留時(shí)間還有檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)過程中分別選擇乙腈-水或甲醇-水為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以1.00、5.00、10.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，甲醇-水為流動(dòng)相信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)于乙腈-水，且無雜質(zhì)峰，而乙腈-水出現(xiàn)了一個(gè)大雜峰，可能是溶劑峰，所以選用甲醇-水作為流動(dòng)相見圖3。在流動(dòng)相中加入甲酸，可以對(duì)峰型有所改善，還可以增加其離子化效率、提高靈敏度，但加入過多的酸則會(huì)抑制目標(biāo)物的離子化，進(jìn)而降低靈敏度。實(shí)驗(yàn)選用了0.1%、0.2%、0.3%、0.5%體積分?jǐn)?shù)的甲酸含量，結(jié)果表明，以含0.1%體積分?jǐn)?shù)甲酸的甲醇溶液為流動(dòng)相時(shí)效果最好。

2.7 兩種方法在樣品前處理時(shí)間上的比較

由表5可見，使用國標(biāo)方法GB/T22260—2008需要45 min，而使用本方法只需要15 min，大大縮短了前處理的時(shí)間。

圖3 以甲醇-水(A)和乙腈-水(B)為流動(dòng)相的5.00 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液圖譜Fig.3 Chromatogram of a standard solution with 5.00 ng·mL-1 of MET by methanol water (A) and acetonitrile water (B)as mobile phase

表5 兩種方法在樣品前處理時(shí)間上的比較

Tab.5 Comparison of two methods in detection of sample pretreatment time min

圖4 MET標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Standard curve of MET

2.8 線性范圍、檢出限及定量下限

用MET標(biāo)準(zhǔn)使用液配制質(zhì)量濃度分別為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測(cè)定后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，MET的線性方程及相關(guān)系數(shù)為y=1.53e5x+2.4e4(r=0.999 9)，詳見圖4。結(jié)果表明，在0.500～10.00 μg/L MET線性良好。以信噪比S/N=3和S/N=10對(duì)應(yīng)的藥物濃度分別定義為方法的檢出限(LOD)與定量限(LOQ)，將加標(biāo)質(zhì)量濃度逐級(jí)稀釋添加于空白飼料樣品中測(cè)定信噪比，最終確定該方法的檢出限為2.00 μg/kg，定量限為5.00 μg/kg。

2.9 準(zhǔn)確度和精密度

在空白草魚飼料、對(duì)蝦飼料和魚蝦混養(yǎng)配合飼料中，加入MET標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為5.00、10.00、50.00 μg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品。測(cè)定結(jié)果顯示，改良后的方法其加標(biāo)回收率都在80%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.0%以下，具體回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表6。

表6 MET加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.6 Recovery and relative standard deviation (RSD ) of MET-fortified samples n=6

3 結(jié)論

通過對(duì)提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、固相萃取柱、洗脫液濃縮方式、質(zhì)譜條件和流動(dòng)相組成等對(duì)加標(biāo)回收率有影響的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了水產(chǎn)飼料中MET含量測(cè)定的最佳測(cè)定條件。在此條件下測(cè)定飼料中MET含量，其前處理簡便、回收率和精密度高，MET質(zhì)量濃度在0.50～10.00 μg/L內(nèi)線性良好，方法檢出限為2.00 μg/kg，定量限為5.00 μg/kg。結(jié)果表明，該法適用于大批量水產(chǎn)飼料中MET的檢測(cè)。

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Rapiddetermination of methyltestosterone in feed by ultra-performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry

YANG Jinlan1, CHEN Jun1*, CHEN Chengtong1, GUAN Xin1, LIU Xiufen1, CHEN Jiaxun2

(1.Guangzhou Environmental Monitoring Center of Ocean and Fishery, Guangzhou 510235, China; 2. Guangdong Provincial PublicLaboratory of Analysis and Testing Technology, China National Analytical Center, Guangzhou 510070, China)

Ultra-performance liquid chromato graphy-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) analysis method was established for methyltestosterone in feed. It optimized the factors affecting recovery, such as volume fraction of methanol extract, time of extract, selection of solid phase extraction column, concentrated way, mass spectrometry conditions and mobile phase etc. The sample was extracted by 40% methanol aqueous, and was then purified with C18solid phase, and measured by UPLC-MS. The calibration curve was linear with a correlation coefficient of over 0.999 9 within the concentration range of 0.50-10.00 μg/L. The limit of detection was 2.00 μg/kg and the limit of quantitation was 5.00 μg/kg. The method developed in this study is suitable for rapid determination of methyltestosterone residues in large batches of feed. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(3):38-43]

ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; feed; methyltestosterone; detection

CHEN Jun, quanjun7391@sina.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.03.006

2016-12-09；接收日期：2017-01-23

2016年省級(jí)漁港建設(shè)和漁業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2130199)

楊金蘭(1986-)，女，工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全研究，527977629@qq.com

陳俊，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楹Ｑ笈c漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)及水產(chǎn)品質(zhì)量安全，quanjun7391@sina.com

S91

A

2095-1833(2017)03-0038-06