楊修軍 張煒煜 張立夫 李可維

?

·短篇論著·

吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因KatG突變特征分析

楊修軍 張煒煜 張立夫 李可維

采用DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)吉林省287株耐多藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行KatG基因序列檢測(cè)，以H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株KatG基因DNA序列為參比序列，分析檢測(cè)菌株KatG基因突變特征。結(jié)果顯示，239株耐多藥結(jié)核分枝桿菌KatG基因發(fā)生突變，突變率為83.28%(239/287)；共涉及13個(gè)突變位點(diǎn)，最常見點(diǎn)突變位點(diǎn)為KatG315，突變率為58.18%(167/287)。

分枝桿菌，結(jié)核； 抗藥性，多種，細(xì)菌； 異煙肼； 多態(tài)性，單核苷酸

異煙肼(INH)是結(jié)核病治療中最主要的一線藥物，同利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、鏈霉素(Sm)一樣是現(xiàn)代結(jié)核病控制策略短期化療的基礎(chǔ)藥物[1]。KatG基因的突變、部分缺失是INH耐藥的重要機(jī)制之一，該基因的完全缺失使得過氧化氫酶-過氧化物酶完全失活，從而導(dǎo)致對(duì)INH的高度耐藥。KatG基因是結(jié)核分枝桿菌中過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因，該基因全長為2222個(gè)核苷酸。本研究旨在探討吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株INH耐藥相關(guān)基因KatG基因的突變特征。

材料和方法

1.菌株來源：本實(shí)驗(yàn)所涉及370株結(jié)核分枝桿菌菌株，包括耐多藥菌株287株、INH敏感菌株82株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株1株，均由吉林省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室傳代、培養(yǎng)、保存。287株耐多藥菌株來源于吉林省4個(gè)結(jié)核病耐藥監(jiān)測(cè)地區(qū)，收集自2013年9月至2015年6月期間，藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)鑒定為RFP和INH同時(shí)耐藥。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)為質(zhì)控菌株，由中國疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)，吉林省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳代保藏。

2.藥敏試驗(yàn)：采用比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[2]，包括INH、RFP、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)，培養(yǎng)基統(tǒng)一購自珠海貝索公司，且在有效期內(nèi)使用。含藥培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度分別為INH 0.2 μg/ml、RFP 40.0 μg/ml、Ofx 2.0 μg/ml和Km 30.0 μg/ml。

3.細(xì)菌基因組DNA的提取：刮取羅氏培養(yǎng)基上的克隆菌1標(biāo)準(zhǔn)環(huán)，加入到200 μl TE緩沖溶液[三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液](10 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的EP(Eppendorf)離心管中，85 ℃金屬浴30 min滅活，然后100 ℃金屬浴10 min，13 400×g離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新管中即為DNA模板，-20 ℃保存待用。

4.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank記載的H37Rv菌株katG基因序列(Gene ID： 885638，NC_000968.3)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段731 bp(擴(kuò)增區(qū)域?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌全基因組)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列為：上游引物：5′-GATCGTCGGCGGTCACACTT-3′；下游引物：5′-CGTTGACCTCCCACCC-GACT-3′。

5. PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定：采用50 μl PCR反應(yīng)體系，包括DNA模板2 μl，Gene Star預(yù)混PCR反應(yīng)液 20 μl，引物(10 μmol/L)各2 μl，DEPC水(經(jīng)焦碳酸二乙酯處理高溫滅菌的純水，不含DNA、RNA和蛋白質(zhì))24 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Qiagen全自動(dòng)電泳儀檢測(cè)后，目的基因片段陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

6.DNA序列分析：應(yīng)用Mega 6.06軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與H37Rv的KatG序列進(jìn)行比對(duì)分析。

結(jié) 果

1. PCR擴(kuò)增結(jié)果：1株H37Rv菌株和82株INH敏感菌株均擴(kuò)增到KatG基因；287株耐多藥菌株中270株擴(kuò)增到KatG基因，檢出率為94.08%(270/287)，17株耐多藥菌株未檢測(cè)到KatG基因擴(kuò)增產(chǎn)物，KatG完全缺失率為 5.92%(17/287)。

2.產(chǎn)物測(cè)序和比對(duì)分析：將270株耐多藥菌株、82株INH敏感菌株的KatG基因測(cè)序結(jié)果采用基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)進(jìn)行分析。

3.KatG基因多態(tài)性分析：H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株KatG基因測(cè)序數(shù)據(jù)與參比序列比對(duì)結(jié)果一致。82株INH敏感菌株KatG基因測(cè)序數(shù)據(jù)與參比序列比對(duì)，有16株發(fā)生KatG基因第463位點(diǎn)突變，突變形式為精氨酸(Arg)→亮氨酸(Leu)，即CGG→CTG，突變率為 19.51%(16/82)。270株耐多藥菌株KatG基因測(cè)序數(shù)據(jù)與參比序列比對(duì)，共涉及13個(gè)突變位點(diǎn)，21種突變類型，包含3種同義突變。KatG基因總突變率為83.28%(239/287)；KatG基因第315位點(diǎn)突變率為58.18%(167/287)，突變以絲氨酸(Ser)→蘇氨酸(Thy)，即AGC→ACC為主，占50.52%(145/287)。另外，178株發(fā)生ArgKatG463Leu突變，其中56株僅發(fā)生KatG基因第463位點(diǎn)突變，突變率為19.51%(56/287)。具體見表1。

討 論

INH為一種藥物前體，在KatG基因編碼的過氧化氫酶-過氧化物酶作用下，生成異煙酸，作用于結(jié)核分枝桿菌代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是抑制分枝菌酸的合成。有研究發(fā)現(xiàn)，90.7%的耐INH菌株存在KatG基因突變或缺失，特別是KatG基因第315位點(diǎn)發(fā)生率高且與耐藥程度密切相關(guān)[3]。本研究中，KatG基因突變率為83.28%；KatG完全缺失率為5.92%，與現(xiàn)有報(bào)道一致[4-5]。采用測(cè)序手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，約有10%～20%耐INH菌株katG基因完全丟失，表明katG基因完全丟失可能是結(jié)核分枝桿菌耐藥產(chǎn)生的機(jī)制之一[6]。

表1 270株耐多藥結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因KatG 基因突變特征

研究表明，KatG基因315位點(diǎn)突變致使KatG基因活性位點(diǎn)甲基化，使得過氧化氫酶-過氧化物酶失去活化INH的能力。臨床INH耐藥菌株中的KatG基因的突變以KatG315Ser→Thr為主，發(fā)生率高達(dá)45%～75%[7-10]。耐多藥菌株KatG基因第315位點(diǎn)突變率各地報(bào)道均不相同，俄羅斯地區(qū)突變率為93%[11]，南非地區(qū)突變率為97%[12]，中國東部地區(qū)報(bào)道的突變率為72.7%[13]。本研究中，吉林省耐多藥菌株KatG基因第315位點(diǎn)突變率為58.18%，包括堿基突變、堿基缺失和位點(diǎn)聯(lián)合突變等共計(jì)9種突變類型；其中KatG基因315位點(diǎn)突變以Ser→Thr(AGC→ACC)為主，其次為Ser→Asn、Ser→Arg、Ser→Gly，突變率為4.53%、1.05%、0.35%。本研究中INH耐藥基因KatG基因突變除315位點(diǎn)突變外，還涉及12個(gè)位點(diǎn)突變，分別為第298、300、321、322、340、344、345、358、368、463、481、491位點(diǎn)，含有3個(gè)位點(diǎn)的同義突變，合計(jì)突變率為25.78%。

本研究顯示，有16株INH敏感菌株發(fā)生KatG基因463位點(diǎn)突變，突變形式為Arg→Leu(CGG→CTG)，突變率為 19.51%；287株耐多藥菌株中178株發(fā)生KatG基因463位點(diǎn)突變，56株僅為KatG基因第463位點(diǎn)單獨(dú)突變。KatG基因463位點(diǎn)被認(rèn)為是除了第315位點(diǎn)以外最常見的突變位點(diǎn)，國外學(xué)者通過動(dòng)力學(xué)聯(lián)合光譜學(xué)對(duì)含KatG463Leu和KatG463Arg兩種蛋白的特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)二者沒有區(qū)別，而且這兩種純化蛋白在生物體內(nèi)或氧化氫酶-過氧化物酶的參數(shù)未見差別，說明KatG基因第463位點(diǎn)密碼子Arg→Leu 的突變與菌株INH耐藥性沒有關(guān)系[14]，只是一個(gè)和耐藥無關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。本研究中KatG基因擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槿蚪M，涵蓋KatG基因第261、289、315、428、463等熱點(diǎn)位點(diǎn)，研究中有31株耐多藥菌株未檢測(cè)到KatG基因突變，這些菌株可能存在其他的耐藥位點(diǎn)或耐藥機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，吉林省耐多藥結(jié)核分枝桿菌INH耐藥相關(guān)基因KatG基因的高突變率和突變類型的多樣性，提示通過檢測(cè)KatG基因高突變位點(diǎn)可以更好地預(yù)測(cè)本省結(jié)核病中耐INH情況，為進(jìn)一步建立耐多藥菌株的快速檢測(cè)方法提供理論和數(shù)據(jù)支持。

[1] World Health Organization. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and respones. Geneva: World Health Organization,2010.

[2] 中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì). 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程. 北京: 中國教育文化出版社, 2006: 49-51.

[3] 蔡捷, 劉小香, 李召東, 等. 結(jié)核分枝桿菌臨床菌株katG、inhA和ahpC基因突變與異煙肼耐藥的相關(guān)性研究. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2013, 23(6)：1430-1432.

[4] Zhang M, Yue J, Yang YP, et al. Detection of mutations associated with isoniazid resistance inMycobateriumtuberculosisisolates from China. J Clin Microbiol, 2005, 43(11): 5477-5482.

[5] 甄偉, 石大偉, 趙玉玲, 等. 耐多藥結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥相關(guān)基因katG突變分析.中國防癆雜志, 2013, 35(3): 207-209.

[6] 予季, 熊亮國, 張慧慧, 等. 聚合酶鏈反應(yīng)-測(cè)序技術(shù)快速檢測(cè)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌KatG基因突變的研究. 江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn), 2007, 25(6): 549-550,568.

[7] 魏淑貞, 陳求揚(yáng), 鄭金鳳, 等. 福建省46株耐多藥結(jié)核分枝桿菌katG基因突變特征研究. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2012, 22(9): 2078-2080, 2087.

[8] Dalla Costa ER, Ribeiro MO, Silva MS, et al. Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility inMycobacteriumtuberculosisclinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America. BMC Microbiol, 2009, 9:39.

[9] 管記涌, 王嫩寒, 易俊莉, 等. MTBDR plus方法快速檢測(cè)北京地區(qū)臨床結(jié)核分枝桿菌分離株利福平和異煙肼耐藥性效果評(píng)價(jià). 中國防癆雜志, 2010, 32(10): 611-614.

[10] 馬俊, 陳高瞻, 董潔莉, 等. 武漢地區(qū)耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌臨床分離株KatG基因突變的分子特征分析. 中國防癆雜志, 2015, 37(1): 95-97.

[11] Hillemann D, Weizenegger M, Kubica T, et al. Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isnoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosiscomplex isolates. J Clin Microbiol, 2005, 43(8): 3699-3703.

[12] Hoshide M, Qian L, Rodrigues C, et al. Geographical dif-ferences associated with single-nucleotide polymorphisms(SNP) in nine gene targets among resistant clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol, 2014, 52(5): 1322-1329.

[13] Luo T, Zhao M, Li X, et al. Selection of mutation to detect multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains in Shanghai, China. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(3): 1075-1081.

[14] Johnsson K, Allemann RK, Widmer H, et al. Synthesis, structure and activity of artificial, rationally designed catalytic polypeptides. Nature, 1993, 365(6446): 530-532.

(本文編輯：李敬文)

Mutation characteristics of theKatGgene of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province

YANGXiu-jun,ZHANGWei-yu,ZHANGLi-fu,LIKe-wei.

DepartmentofMicrobiologyTesting,JilinProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changchun130062,China

ZHANGWei-yu,Email: 81637146@qq.com

Mutations characteristics ofkatGgenes in 287 multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province were analyzed by DNA sequencing technique, H37Rv standard strain was selected as control. The results showed that mutation ofkatGgene occurred in 239 multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(83.28% (239/287)), involving 13 mutation sites. The most common mutation site wasKatG315 (58.18% (167/287)).

Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, multiple, bacterial; Isoniazid; Polymorphism, single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.022

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2015ZC037)

130062 長春，吉林省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)所

張煒煜，Email：81637146@qq.com

2017-01-09)