孫嬌 王悅 孫秀華 彭嬌 邢黎莉 孫炳奇

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·論著·

環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)疑似結(jié)核病患者的篩查效果

孫嬌 王悅 孫秀華 彭嬌 邢黎莉 孫炳奇

目的 評(píng)價(jià)環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)對(duì)疑似結(jié)核病患者的篩查效果。方法 選取沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院2015年5月至2016年6月收治的疑似結(jié)核病患者604例，收集標(biāo)本604份，其中痰標(biāo)本503份，胸腔積液抽取液98份，支氣管肺泡灌洗液3份，分別行涂片抗酸染色鏡檢(簡(jiǎn)稱“涂片鏡檢”)、改良羅氏固體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“固體培養(yǎng)”)、MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“液體培養(yǎng)”)和LAMP檢測(cè)，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)4種檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核病患者的檢測(cè)效能，采用χ2檢驗(yàn)比較結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 以臨床診斷結(jié)果為參照，LAMP檢測(cè)、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)的敏感度分別為72.78%(262/360)、51.67%(186/360)、66.67%(240/360)和59.17%(213/360)；特異度分別為88.11%(215/244)、99.59%(243/244)、99.59%(243/244)和99.59%(243/244)，并且具有良好的一致性(Kappa值依次為0.58、0.46、0.61和0.54)。LAMP檢測(cè)對(duì)病程<1年患者的陽(yáng)性檢出率[45.76%(189/413)]明顯高于涂片鏡檢[27.12%(112/413)]、液體培養(yǎng)[37.05%(153/413)]和固體培養(yǎng)[31.48%(130/413)](χ2=62.41、16.62、40.95，P值均=0.000)。當(dāng)患者出現(xiàn)的臨床癥狀≤5個(gè)時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率(44.37%，268/604)明顯高于涂片鏡檢(28.15%，170/604)、液體培養(yǎng)法(36.75%，222/604)和固體培養(yǎng)法(32.12%，194/604)(χ2值分別為76.22、21.59和47.21，P值均=0.000)。LAMP檢測(cè)對(duì)涂片鏡檢陰性，液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)陰性標(biāo)本具有較高的陽(yáng)性檢出率[分別為28.78%(120/417)，(21.49%(78/363)和25.90%(101/390)]。結(jié)論 LAMP技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌較涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)檢測(cè)效能高，適用于病程短、臨床癥狀較輕(1～5個(gè)癥狀)、涂陰和培陰的疑似結(jié)核病患者的篩查。

核酸擴(kuò)增技術(shù)； 結(jié)核，肺； 多相篩查； 對(duì)比研究

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種全球性的慢性傳染病，2015年全球新發(fā)患者估算約為1040萬(wàn)例，但由于缺乏檢測(cè)病原菌準(zhǔn)確、快速、有效的技術(shù)手段，造成很多患者漏診，實(shí)際報(bào)告的患者例數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這一數(shù)據(jù)[1-3]。近年來(lái)，分子生物學(xué)診斷方法發(fā)展迅猛，并以其高敏感度、高特異度和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)而備受推崇。然而，同傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法(簡(jiǎn)稱“涂片鏡檢”)、MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“液體培養(yǎng)”)和改良羅氏固體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“固體培養(yǎng)”)相比較，分子生物學(xué)的檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高，這也限制了此類技術(shù)在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的廣泛應(yīng)用。既能發(fā)揮分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，又能避免該檢測(cè)技術(shù)的過(guò)度使用，已成為必須面對(duì)的難題。筆者以臨床確診的患者為檢測(cè)參照，對(duì)比分析了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)與涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)對(duì)疑似結(jié)核病患者的檢測(cè)結(jié)果，以期發(fā)現(xiàn)適合LAMP技術(shù)的人群，達(dá)到快速、經(jīng)濟(jì)、有效、準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病的目的。

資料和方法

一、一般資料

1.患者的基本情況：選取沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院2015年5月至2016年6月收治的疑似結(jié)核病患者604例，其中男426例，年齡16～93歲，平均(52.08±17.63)歲；女178例，年齡11～89歲，平均(49.87±19.88)歲。采集各類標(biāo)本604份(每例患者提供1份標(biāo)本，痰標(biāo)本優(yōu)先)，其中痰標(biāo)本503份(晨起痰)，胸腔積液抽取液98份，支氣管肺泡灌洗液3份。最終臨床確診的肺結(jié)核患者為360例，未確診患者為244例(由于缺乏檢測(cè)病原菌準(zhǔn)確、快速、有效的技術(shù)手段，造成目前臨床診斷的結(jié)核病患者例數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于實(shí)際患者數(shù))。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

2.研究項(xiàng)目：大多數(shù)的文獻(xiàn)研究均按照標(biāo)本類型進(jìn)行分析[4-8]，可經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LAMP對(duì)不同年齡、病程、臨床癥狀和肺部病變嚴(yán)重程度不同的患者其篩查效果是不同的，因此筆者嘗試依據(jù)患者的不同臨床特點(diǎn)(年齡、病程、臨床癥狀數(shù)量和肺部病變嚴(yán)重程度)分別進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以期發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)對(duì)不同臨床特點(diǎn)患者檢測(cè)效果的差異。(1)本組患者年齡分布情況：<20歲16例，20～歲149例，40～歲239例，≥60歲200例。(2)本組患者病程分布情況：<1年413例，1～5年117例，6～10年31例，11～20年13例，>20年30例。(3)本組患者臨床癥狀發(fā)生個(gè)數(shù)分布情況：分析結(jié)核病患者常見的7個(gè)臨床癥狀(發(fā)熱、咳嗽、咯痰、咯血、消瘦、盜汗和胸痛)，≤2個(gè)癥狀83例，3個(gè)癥狀167例，4個(gè)癥狀194例，5個(gè)癥狀113例，6個(gè)癥狀42例，7個(gè)癥狀5例。(4)本組患者肺部發(fā)生空洞的情況：有空洞133例，無(wú)空洞471例。

二、診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.疑似肺結(jié)核：為胸部影像學(xué)檢查符合結(jié)核病影像學(xué)特征者，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)參見《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》[9]。

2.肺結(jié)核臨床診斷：所有研究對(duì)象均經(jīng)臨床癥狀及體征、胸部影像學(xué)檢查、標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查，來(lái)確診肺結(jié)核(診斷標(biāo)準(zhǔn)參見《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》[9])。

三、檢測(cè)方法

本研究分別采用LAMP檢測(cè)、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)對(duì)標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，所有檢測(cè)均在標(biāo)本采集后2 h內(nèi)進(jìn)行，避免因標(biāo)本長(zhǎng)期保存、細(xì)菌活力下降而造成檢測(cè)結(jié)果異常。

1.涂片鏡檢：對(duì)采集的標(biāo)本進(jìn)行熒光法涂片鏡檢(金胺O染色)，標(biāo)本的收集、涂片、鏡檢流程按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[10]進(jìn)行操作。結(jié)果報(bào)告抗酸桿菌陰性為連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；若發(fā)現(xiàn)1條以上，即報(bào)告為陽(yáng)性。

2.結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌培養(yǎng)：取1 ml標(biāo)本，向其加入1～1.5 ml的4%N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH枸櫞酸鈉溶液進(jìn)行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20 s，直至標(biāo)本充分液化。將離心管室溫靜置15 min，加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)至40 ml，3000×g離心20 min。取100 μl和500 μl處理后的樣品分別接種至分枝桿菌生長(zhǎng)指示管[10]和改良羅氏培養(yǎng)基[11]中，37 ℃溫箱培養(yǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)指示管呈陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)該培養(yǎng)物涂片抗酸染色也為陽(yáng)性時(shí)，報(bào)告液體培養(yǎng)陽(yáng)性。固體培養(yǎng)結(jié)果判定為接種后第3天和第7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，直至第8個(gè)周末，無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)告培養(yǎng)陰性，發(fā)現(xiàn)典型結(jié)核分枝桿菌菌落形態(tài)即報(bào)告為陽(yáng)性。

3. LAMP檢測(cè)：本研究中LAMP檢測(cè)所用試劑盒(loop amp PURE DNA提取試劑盒和loop amp MTBC檢測(cè)試劑盒)為日本榮研株式會(huì)社的商品化試劑盒，所有操作均嚴(yán)格遵循操作說(shuō)明書。將60 μl樣本加入吸附劑試管中，充分混勻并加熱裂解(90 ℃，5 min)。然后，將吸附試管裝到樣本處理管上，搖晃幾次后得到初提的核酸，在樣本處理管上加上滴注蓋，輕壓樣本處理管將樣本滴入到反應(yīng)管中。蓋上管蓋，充分混合后即可進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后直接放入熒光目視檢測(cè)單元，通過(guò)自帶的紫外線激發(fā)熒光觀察反應(yīng)結(jié)果。陽(yáng)性：發(fā)出綠色熒光；陰性：未發(fā)出熒光。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以臨床診斷結(jié)果為檢測(cè)參考，計(jì)算各種檢測(cè)方法的敏感度、特異度、一致性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。采用χ2檢驗(yàn)比較4種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌不同情況下的陽(yáng)性檢出率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4

2.相關(guān)公式：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

1. 不同標(biāo)本類型經(jīng)4種方法檢測(cè)的結(jié)果分析：對(duì)604份標(biāo)本分別進(jìn)行LAMP檢測(cè)、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)，結(jié)果顯示LAMP檢測(cè)具有很高的敏感度、特異度及一致性，尤其是對(duì)胸腔積液的檢測(cè)，其敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于涂片法及培養(yǎng)法，詳見表1，2。

2. LAMP技術(shù)對(duì)不同標(biāo)本類型及患者的檢測(cè)效果：LAMP對(duì)痰標(biāo)本、胸腔積液的陽(yáng)性檢出率明顯優(yōu)于涂片鏡檢和培養(yǎng)法(P值均<0.01)，而肺泡灌洗液由于標(biāo)本數(shù)量過(guò)少，故無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；對(duì)<20歲患者的陽(yáng)性檢出率與涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，而對(duì)>20歲患者的檢出率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)；對(duì)病程<1年患者的陽(yáng)性檢出率明顯高于涂片鏡檢和培養(yǎng)法(P值均<0.01)，但對(duì)于病程>5年的患者，上述檢測(cè)技術(shù)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)肺部有或無(wú)空洞患者的陽(yáng)性檢出率均明顯高于涂片鏡檢法和培養(yǎng)法。詳見表3。

3.臨床癥狀的數(shù)量與不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率的關(guān)系：統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，隨著患者癥狀的不斷增多，各種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率逐漸增高，當(dāng)患者的臨床癥狀≤5個(gè)時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率(44.37%，268/604)明顯高于涂片鏡檢(28.15%，170/604)、液體培養(yǎng)法(36.75%，222/604)和固體培養(yǎng)法(32.12%，194/604)(χ2值分別為76.22、21.59和47.21，P值均=0.000)，但當(dāng)患者的臨床癥狀≥6個(gè)時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率(3.81%，23/604)與涂片鏡檢(2.81%，17/604)、液體培養(yǎng)法(3.15%，19/604)和固體培養(yǎng)法(3.31%，20/604)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.50,P=0.114；χ2=1.13，P=0.289；χ2=0.44，P=0.505)，詳見表4。

表1 不同標(biāo)本類型經(jīng)4種方法檢測(cè)的結(jié)果分析(例)

表2 不同標(biāo)本類型經(jīng)4種方法檢測(cè)的效能比較

注 敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；Kappa值≥0.75兩者一致性較好；0.4

表3 604例疑似結(jié)核病患者不同情況下4種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率統(tǒng)計(jì)

注a：LAMP與涂片鏡檢檢出率比較的統(tǒng)計(jì)值；b：LAMP與MGIT960培養(yǎng)檢出率比較的統(tǒng)計(jì)值；c：LAMP與羅氏培養(yǎng)檢出率比較的統(tǒng)計(jì)值

表4 604例患者臨床癥狀數(shù)量與不同檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率的關(guān)系

注 括號(hào)外數(shù)值為患者例數(shù)，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為發(fā)生率(%)或陽(yáng)性檢出率(%)；a：LAMP與涂片鏡檢比較的統(tǒng)計(jì)值；b：LAMP與MGIT960培養(yǎng)比較的統(tǒng)計(jì)值；c：LAMP與羅氏比較的統(tǒng)計(jì)值；“-”無(wú)法計(jì)算

4. LAMP檢測(cè)結(jié)果與不同標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間的關(guān)系：在液體培養(yǎng)陽(yáng)性的241份標(biāo)本中，隨著陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間的延長(zhǎng)，LAMP的陽(yáng)性檢出率不斷下降，從96.92%降至62.50%，均偏低于液體培養(yǎng)法，但11～15 d是檢出率最高的時(shí)間；同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在固體培養(yǎng)中，當(dāng)陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間從7 d延長(zhǎng)至56 d時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率也從100.00%降至66.67%，其中有1例標(biāo)本固體培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間為7 d(博奧基因芯片法進(jìn)行菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌)，詳見表5。

5.LAMP對(duì)涂陰或培陰標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率：LAMP對(duì)涂片鏡檢陰性、液體培養(yǎng)陰性、固體培養(yǎng)陰性的患者具有較高的陽(yáng)性檢出率[28.78%(120/417)，21.49%(78/363)和25.90%(101/390)]，達(dá)到20%～30%；而對(duì)于LAMP-TB檢測(cè)陰性的標(biāo)本，涂片鏡檢、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)檢測(cè)則只有不到10%的陽(yáng)性檢出率[5.11%(16/313)、8.95%(28/313)和7.67%(24/313)]。詳見表6。

表5 兩種培養(yǎng)法陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間與LAMP檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系

注 “-”為未統(tǒng)計(jì)

表6 LAMP對(duì)涂陰、培陰標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率

注 括號(hào)外數(shù)值為標(biāo)本份數(shù)，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為陽(yáng)性檢出率(%)

討 論

WHO結(jié)核病疫情報(bào)告指出，每年有大量的結(jié)核病患者被漏診，可能因?yàn)樾掳l(fā)患者病程較短、缺乏明顯的臨床癥狀表現(xiàn)，多在常規(guī)體檢中發(fā)現(xiàn)肺部影像學(xué)改變而就診，此時(shí)如果實(shí)驗(yàn)室檢查不能檢出病原菌，臨床醫(yī)生往往無(wú)法做出結(jié)核病診斷，造成延誤治療。目前，很多關(guān)于LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的研究[12-24]都是對(duì)其高的特異度和敏感度的評(píng)價(jià)，本研究也分析了相關(guān)數(shù)據(jù)，結(jié)果與上述文獻(xiàn)相符。然而，對(duì)于不同的人群，如病程長(zhǎng)短和癥狀嚴(yán)重程度等的檢測(cè)，LAMP技術(shù)與傳統(tǒng)涂片鏡檢和培養(yǎng)法相比較，是否存在明顯的優(yōu)勢(shì)還需要探討。

本研究顯示，LAMP對(duì)于不同標(biāo)本類型的檢測(cè)，痰標(biāo)本無(wú)疑是陽(yáng)性檢出率最高的(51.49%，259/503)，但也發(fā)現(xiàn)，對(duì)胸腔積液的陽(yáng)性檢出率也達(dá)到了31.63%(31/98)，明顯高于以往我院涂片鏡檢和培養(yǎng)法的結(jié)果(根據(jù)我院臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我院近3年胸腔積液MGIT 960液體培養(yǎng)共5810例，陽(yáng)性424例，陽(yáng)性檢出率僅為7.30%；固體培養(yǎng)349例，陽(yáng)性15例，陽(yáng)性檢出率為4.30%；涂片鏡檢4281例，陽(yáng)性13例，陽(yáng)性檢出率為0.28%)。上述結(jié)果提示傳統(tǒng)涂片鏡檢和培養(yǎng)法對(duì)胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)效果不理想，導(dǎo)致臨床缺乏診斷結(jié)核性胸膜炎的重要證據(jù)。造成這種結(jié)果可能因?yàn)樾厍环e液標(biāo)本是液體性質(zhì)，涂片時(shí)對(duì)玻片的附著力較差，在之后的沖洗及脫色過(guò)程中極易出現(xiàn)標(biāo)本脫片現(xiàn)象，直接導(dǎo)致胸腔積液涂片鏡檢的陽(yáng)性檢出率極低；另外，胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌載菌量遠(yuǎn)低于痰標(biāo)本，導(dǎo)致液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率也不高。而LAMP技術(shù)是對(duì)結(jié)核分枝桿菌的核酸進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其敏感度高，在胸腔積液檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

表1，2結(jié)果顯示，在臨床未確診的患者中仍然有部分患者的LAMP檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，因此，我們對(duì)全部604例疑似結(jié)核病患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分析，并將LAMP檢測(cè)結(jié)果與涂片鏡檢和培養(yǎng)法進(jìn)行比較。本研究對(duì)患者病程長(zhǎng)短的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者病程<1年時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率明顯高于涂片鏡檢及培養(yǎng)法(P值均<0.01)；病程為1～5年時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率與液體培養(yǎng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與涂片鏡檢和固體培養(yǎng)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；當(dāng)病程>5年時(shí)，LAMP與涂片鏡檢和培養(yǎng)法的陽(yáng)性檢出率間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。同樣，通過(guò)對(duì)患者臨床癥狀數(shù)量的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)患者癥狀≤5個(gè)時(shí)，LAMP的陽(yáng)性檢出率明顯高于其他3種檢測(cè)方法(P值均<0.05)；而對(duì)于臨床癥狀≥6個(gè)的患者，LAMP檢測(cè)并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，可能因?yàn)榘Y狀重、病程長(zhǎng)的患者多反復(fù)治療、遷延不愈，肺部病變較嚴(yán)重(如肺部出現(xiàn)空洞等)、排菌量較大，大多可以通過(guò)涂片鏡檢和培養(yǎng)法檢出，此時(shí)傳統(tǒng)涂片鏡檢和培養(yǎng)法足以保證病原學(xué)檢測(cè)的有效性，對(duì)于這類患者，沒有必要為了追求更高的陽(yáng)性檢出率而放棄傳統(tǒng)檢測(cè)手段。不過(guò)，由于本研究的樣本量有限，結(jié)論可能存在偏倚，在今后的研究中會(huì)增加觀察的樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

眾所周知，標(biāo)本培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果的時(shí)間與標(biāo)本的載菌量密切相關(guān)，標(biāo)本載菌量越大，培養(yǎng)后報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間越短。本研究依據(jù)MGIT 960液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間長(zhǎng)短不同對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)隨著報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間的延長(zhǎng)，LAMP對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率呈下降趨勢(shì)，這與以往的研究結(jié)果可能有些不符[13]，可能是由于報(bào)告陽(yáng)性時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本，其載菌量越小，LAMP的陽(yáng)性檢出率也越低。但是，這樣的結(jié)果是否說(shuō)明LAMP技術(shù)的檢測(cè)能力低于培養(yǎng)法呢？筆者進(jìn)而比較了LAMP對(duì)涂陰或培陰標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率能夠達(dá)到20%～30%；而反過(guò)來(lái)分析發(fā)現(xiàn)，涂片鏡檢和培養(yǎng)法對(duì)LAMP檢測(cè)陰性的標(biāo)本陽(yáng)性檢出率只有不到10%，提示LAMP技術(shù)的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，即對(duì)涂陰培陰標(biāo)本具有很高的陽(yáng)性檢出率。

研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一些培養(yǎng)陽(yáng)性而LAMP檢測(cè)陰性的標(biāo)本，可能因?yàn)榇祟悩?biāo)本載菌量較低，培養(yǎng)法前處理時(shí)加入的樣本量為1～2 ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于LAMP檢測(cè)的60 μl，因此培養(yǎng)法比LAMP更易檢測(cè)到標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，造成培養(yǎng)陽(yáng)性而LAMP陰性的結(jié)果。建議對(duì)于這類標(biāo)本可以在檢測(cè)前進(jìn)行濃縮處理，可以將標(biāo)本離心后再進(jìn)行LAMP檢測(cè)，這樣可以在一定程度上提高LAMP的陽(yáng)性檢出率。然而，我們并不能因此就否定LAMP檢測(cè)技術(shù)的高敏感度，畢竟培養(yǎng)陽(yáng)性而LAMP檢測(cè)陰性的標(biāo)本是極少的一部分，從標(biāo)本的總體檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，其陽(yáng)性檢出率還是明顯高于培養(yǎng)法。另外，對(duì)于那些培養(yǎng)陰性而LAMP檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本，筆者認(rèn)為并不是標(biāo)本中不存在結(jié)核分枝桿菌而造成LAMP檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性，而是因?yàn)闃?biāo)本載菌量低于培養(yǎng)法的檢測(cè)下限，建議對(duì)于這部分患者的診斷應(yīng)積極結(jié)合LAMP的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行臨床綜合診斷，行診斷性治療后會(huì)發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)對(duì)培養(yǎng)陰性的標(biāo)本具有很高的陽(yáng)性檢出率。

通過(guò)研究數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于診斷那些病程短、癥狀較輕、標(biāo)本含菌量少(甚至是涂陰與培陰的標(biāo)本)的患者。然而，對(duì)于病程長(zhǎng)、癥狀重的患者，LAMP檢測(cè)在陽(yáng)性檢出率上并無(wú)明顯的優(yōu)勢(shì)，且不能像培養(yǎng)法一樣提供藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。故筆者認(rèn)為，沒有必要將LAMP檢測(cè)作為這些患者的常規(guī)檢測(cè)手段，而是應(yīng)該把有限的資金用在培養(yǎng)法及藥物敏感性試驗(yàn)上，為臨床醫(yī)生用藥提供科學(xué)有效的技術(shù)支持。

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(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Screening effect of loop-mediated isothermal amplification for suspected tuberculosis

SUNJiao,WANGYue,SUNXiu-hua,PENGJiao,XINGLi-li,SUNBing-qi.

TuberculosisLaboratory,Shenyang10thPeople’sHospital,Shenyang110044,China

SUNJiao,Email:zhiyuanmantian@hotmail.com

Objective To evaluate screening effect of loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) for suspected tuberculosis. Methods A total of 604 suspected tuberculosis patients from Shenyang 10th People’s Hospital between May 2015 and June 2016 were selected, and 604 specimens were collected, including 503 sputum, 98 pleural effusions and 3 bronchoalveolar lavage fluid. All specimens were examined by smear microscopy, solid culture, MGIT 960 liquid culture and LAMP, in order to test the different efficacy of four methods, based on clinical diagnosis. The positive detection rate was analyzed byχ2test, andP<0.05 was considered statistically significant. Results Compared with clinical diagnosis, sensitivities of these four methods were 72.78% (262/360), 51.67% (186/360), 66.67%(240/360) and 59.17% (213/360), respectively; and the specificities were 88.11% (215/244), 99.59% (243/244), 99.59% (243/244) and 99.59% (243/244), what’s more, the consistency was good (Kappavalue were 0.58, 0.46, 0.61 and 0.54, respectively). The positive detection rate of LAMP in patients with short course (less than 1 year) (45.76% (189/413)) was significantly higher than those of smear microscopy (27.12% (112/413)), MGIT 960 culture (37.05% (153/413)) and solid culture (31.48% (130/413)) (χ2=62.41, 16.62, 40.95, respectively, allP=0.000). In patients with less than 5 symptoms, positive detection rate of LAMP (44.37% (268/604)) was significantly higher than those of microscopy (28.15% (170/604)), liquid culture (36.75% (222/604)) and solid culture (32.12% (194/604)) (χ2=76.22, 21.59 and 47.21, respectively, allP=0.000). For smear negative, liquid culture negative and solid culture negative specimens, LAMP also had high positive detection rate (28.78% (120/417), 21.49% (78/363) and 25.90% (101/390), respectively). Conclusion LAMP is more effective than microscopy, liquid culture and solid culture. It is suitable for the screening of suspected tuberculosis patients with short course, mild clinical symptoms (less than 5 symptoms), smear negative and culture negative.

Nucleic acid amplification techniques； Tuberculosis，pulmonary； Multiphasic screening； Comparative study

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.010

110044 沈陽(yáng)市第十人民醫(yī)院結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室

孫嬌，Email:zhiyuanmantian@hotmail.com

2017-02-13)