陸景偉， 朱文獻(xiàn)， 蘇文利， 王毅鑫

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院急診科， 上海 普陀區(qū) 200062)

參附注射液對(duì)于失血性休克大鼠動(dòng)物模型的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體的影響

陸景偉， 朱文獻(xiàn)， 蘇文利， 王毅鑫

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院急診科， 上海 普陀區(qū) 200062)

目的：本研究旨在探討參附注射液對(duì)于失血性休克大鼠動(dòng)物模型腎臟內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(EPCR)表達(dá)的影響及其可能的機(jī)制。方法：成年健康SD大鼠50只，隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組、假手術(shù)組、失血性休克組、林格液復(fù)蘇組、參附注射液復(fù)蘇組，每組10只。建立失血性休克大鼠動(dòng)物模型成功后，林格液組采用林格液復(fù)蘇；參附注射液組采用參附注射液(10mL/kg)和林格液組成的液體復(fù)蘇。休克后6h分別處死大鼠，留取外周血清和腎組織，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清尿素氮和肌酐水平，采用免疫組化檢測(cè)腎臟的損傷程度，采用RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)腎臟組織EPCR的表達(dá)。結(jié)果：與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比較，失血性休克組大鼠血清尿素氮和肌酐水平，腎組織EPCR的表達(dá)以及腎臟組織的損傷程度明顯升高(P<0.05)；林格液組和參附注射液組復(fù)蘇后血清尿素氮和肌酐水平，腎組織EPCR的表達(dá)以及腎臟組織的損傷程度均明顯下降，差異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中，參附注射液組的下降程度更加明顯，與林格液組相比較，差異差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：失血性休克大鼠的血清尿素氮和肌酐水平，以及腎臟組織EPCR表達(dá)增加，這與失血性休克時(shí)腎臟損傷有關(guān)。參附注射液可以抑制腎組織EPCR的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟功能的作用。

失血性休克； 腎損傷； 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體； 參附注射液

大手術(shù)、主動(dòng)脈瘤破裂、消化道大出血以及外傷等導(dǎo)致的血液大量丟失常常導(dǎo)致失血性休克(hemorrhagic shock， HS)。研究發(fā)現(xiàn)，大約1/3的HS患者會(huì)發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)[1]。AKI會(huì)導(dǎo)致HS患者多器官衰竭發(fā)病率和死亡率增加[2]。腎臟組織對(duì)于血液低灌注和缺氧非常敏感。HS導(dǎo)致的腎臟組織缺氧，會(huì)激活免疫系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)和凝血反應(yīng)，最終導(dǎo)致AKI[3]。目前，已將抗炎和抗凝列為HS新的治療靶點(diǎn)。血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛地參與了機(jī)體的炎癥與凝血過(guò)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，其調(diào)節(jié)炎癥和抗凝的功能下降，進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞黏附，微血栓形成，發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體(endothelial protein C receptor，EPCR)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的位于血管內(nèi)皮細(xì)胞的新型蛋白受體，是體內(nèi)蛋白激酶C系統(tǒng)的重要的組成部分之一[4,5]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的EPCR，致血漿中的可溶性EPCR升高。目前，血漿中可溶性EPCR的水平已被用來(lái)反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的標(biāo)志。但是，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道HS后腎臟組織局部的EPCR的表達(dá)變化。參附注射液源自我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的參附湯，具有“益氣溫陽(yáng)固脫”之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其可以降低血管間黏附分子-1(ICAM一1)、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[6,7]。本研究旨在通過(guò)失血性休克大鼠模型，以血清尿素氮和肌酐水平以及腎組織EPCR的表達(dá)水平為研究指標(biāo)，觀察HS前后的改變，初步探討HS早期AKI損傷的發(fā)生機(jī)制以及參附注射液的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組：成年Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，雄性，年齡6～7周，體重250～300g，購(gòu)買(mǎi)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照簡(jiǎn)單隨機(jī)法隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組、假手術(shù)組、失血性休克組、林格液復(fù)蘇組、參附注射液復(fù)蘇組，每組10只。動(dòng)物房溫度維持在25.0±0.5℃，采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 失血性休克模型的建立：參考Umeda等人[8]的方法。50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉成功后將其仰臥固定于鼠板上。①空白對(duì)照組：不進(jìn)行其他操作，6h后取外周血和腎組織。其余4組均進(jìn)行股動(dòng)靜脈插管。分離右側(cè)股動(dòng)脈，使用PowerLab 15T(ADInstruments，澳大利亞)行動(dòng)脈插管，動(dòng)脈插管經(jīng)三通及壓力傳感器連接多功能監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)。經(jīng)股靜脈放血，液體復(fù)蘇；②假手術(shù)組：動(dòng)靜脈插管后不予其他操作，于6 h后取外周血和腎組織；③失血性休克組：插管成功后，15min內(nèi)放血使MAP降至35mmHg，使其穩(wěn)定60min，即為HS造模成功。6 h后取外周血和腎組織；④林格液復(fù)蘇組：造模成功后，30min內(nèi)輸注3倍失血量的林格液復(fù)蘇。于造模成功后的6h后取外周血和腎組織；⑤參附注射液復(fù)蘇組：參附注射液10mL/kg，再輸入林格液補(bǔ)充至失血量3倍，所有液體在30min內(nèi)輸完。于造模成功后的6h后取外周血和腎組織。

1.3 反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR):RT-PCR檢測(cè)腎組織EPCR mRNA的表達(dá)。參考基因庫(kù)設(shè)計(jì)合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)：EPCR引物系列為：上游引物：5'-TCTACCTGTCCCAGTTCAA-3'；下游引物：5'-CATACCGAGTCCGATTGT-3'。β-actin引物系列為：上游引物：5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3'；下游引物：5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'。采用Trizol試劑盒(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA。按Takara公司說(shuō)明書(shū)的操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)在Gene Amp PCR System 2400型(PE，美國(guó))上進(jìn)行。PCR循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，不同退火溫度(EPCR 53.3℃,β-actin 58℃)退火30s，72 ℃延伸1min，共30～32個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)于72℃延伸5min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL 6 x Loadingbuffer液混合均勻后，用1.5%瓊脂糖凝膠(Sigma, 美國(guó))，5V/cm進(jìn)行電泳，采用Gel3.0行灰度掃描分析。以目的基因與β-actin的PCR產(chǎn)物條帶灰度之比作為反映目的基因mRNA水平的相對(duì)指標(biāo)。

1.4 Western blot檢測(cè):腎臟組織經(jīng)研磨、裂解后用酶標(biāo)儀測(cè)蛋白濃度，根據(jù)所測(cè)得蛋白濃度上樣總蛋白質(zhì)量為 80 μg，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用電印跡轉(zhuǎn)移法將蛋自質(zhì)轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，麗春紅S染色，根據(jù)所需目標(biāo)條帶剪膜，用質(zhì)量濃度為5%的脫脂奶粉的TBS-T溶液室溫封閉2h后，分別加入兔抗大鼠EPCR單克隆抗體(R&D Systems，美國(guó))和 GAPDH 抗體(R&D Systems，美國(guó))，4℃孵育過(guò)夜，室溫下 TBS-T 溶液洗膜后加入二抗(R&D Systems，美國(guó))孵育2 h，用TBS-T 溶液洗膜后與ECL 試劑反應(yīng)，膠片曝光，掃描膠片，用Image J軟件計(jì)算條帶光密度(OD)值，以EPCR與 GAPDH 條帶的 OD 比值來(lái)評(píng)定的 AKT、P-AKT 蛋自質(zhì)的表達(dá)水平。

1.5 病理組織學(xué)檢查:將腎臟置于4%多聚甲醛緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，制成 3～4 μm 厚石蠟切片從上述已制成的石蠟切片中，各組隨機(jī)取3張切片，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，100倍光鏡下觀察，鏡下觀察各組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況，評(píng)價(jià)腎小管受損的情況。腎小管受損采用以下的損傷評(píng)分系統(tǒng)，0分：沒(méi)有腎小管上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；1分：<5%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；2分：5～25%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；3分：25～75%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血；3分：>75%的腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞凋亡，管腔擴(kuò)張或出血。

1.6 血清尿素氮和肌酐水平檢測(cè):取大鼠外周血2mL，3000g離心15min，取上層血清，采用UniCel DxC 800型全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter，美國(guó))測(cè)量血清尿素氮和肌酐水平。

2 結(jié) 果

2.1 五組大鼠的腎組織的EPCR mRNA水平比較:與空白對(duì)照組(0.726±0.458)比較，假手術(shù)組腎組織的EPCR mRNA(1.052±0.619)的表達(dá)升高，但是差異差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；失血性休克組(2.771±0.924)較空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；林格液復(fù)蘇后(1.428±0.617)較失血性休克組表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組(0.951±0.406)較失血性休克組和林格液組的腎組織EPCR mRNA表達(dá)亦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 五組大鼠的腎組織的EPCR蛋白質(zhì)水平比較:與空白對(duì)照組(142±13ng/mL)比較，假手術(shù)組腎組織的EPCR蛋白(145±15ng/mL)質(zhì)的表達(dá)升高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；失血性休克組(282±11ng/m)l較空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；林格液復(fù)蘇后(202±18ng/mL)較失血性休克組表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組(153±15ng/mL)較失血性休克組和林格液組的腎組織EPCR 蛋白質(zhì)表達(dá)亦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 五組大鼠的腎組織的EPCR mRNA水平比較

注：*與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比較，P<0.05；#與失血性休克組相比較，P<0.05；Δ與林格液組相比較，P<0.05

圖2 五組大鼠的腎組織的EPCR 蛋白質(zhì)水平比較

2.3 五組大鼠的血清尿素氮和肌酐水平比較:與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組血清尿素氮和肌酐的水平升高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；失血性休克組較空白對(duì)照組和假手術(shù)組比較均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；林格液復(fù)蘇后較失血性休克組水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；參附注射液組較失血性休克組和林格液組的血清尿素氮和肌酐的水平亦明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 五組大鼠的血清尿素氮和肌酐水平比較

A. 血清尿素氮水平比較; B.血清肌酐水平比較

注：*與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比較，P<0.05；#與失血性休克組相比較，P<0.05；Δ與林格液組相比較，P<0.05

表1 五組大鼠的血清尿素氮和肌酐水平

2.4 五組大鼠的腎臟組織損傷情況比較:空白對(duì)照組(0.34±0.02分)與假手術(shù)組(0.51±0.02分)的腎小管細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，核較大，邊界清楚，染為藍(lán)色。失血性休克組(2.84±0.24分)可見(jiàn)大量的腎小管上皮細(xì)胞水腫和凋亡，腎小管管腔擴(kuò)張，出血。損傷評(píng)分明顯高于空白對(duì)照組與假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；林格液(1.37±0.13分)和參附注射液(0.54±0.01分)復(fù)蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕，損傷評(píng)分明顯低于失血性休克組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4，圖5。

圖4 五組大鼠的腎組織損傷情況比較

A.空白對(duì)照組; B.假手術(shù)組；C.失血性休克組；D.林格液復(fù)蘇組；E. 參附注射液復(fù)蘇組

圖5 五組大鼠的腎組織損傷評(píng)分比較

注：*與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比較，P<0.05；#與失血性休克組相比較，P<0.05；Δ與林格液組相比較，P<0.05)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛地參與了機(jī)體的炎癥與凝血過(guò)程。在機(jī)體發(fā)生失血性休克的時(shí)候，血管內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)各種免疫分子，例如Toll樣受體、補(bǔ)體受體以及T淋巴細(xì)胞共刺激分子等。1994年Fukudome等[9]利用基因克隆技術(shù)首次從內(nèi)皮細(xì)胞基因文庫(kù)中得到了能夠編碼蛋白質(zhì)C的結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，因此命名為EPCR。EPCR是一種I型跨膜蛋白，其分子結(jié)構(gòu)與主要組織相容性復(fù)合物I型分子相似。EPCR通過(guò)與蛋白質(zhì)C結(jié)合，可使蛋白質(zhì)C的活化效率提高5～20倍[10]。EPCR在機(jī)體內(nèi)以結(jié)合型和可溶型兩種形式存在。結(jié)合型EPCR主要存在大血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面。可溶型EPCR(sEPCR)來(lái)自與結(jié)合型EPCR。當(dāng)內(nèi)毒素或凝血酶與大血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸時(shí)，可以通過(guò)蛋白酶-3介導(dǎo)結(jié)合型EPCR從血管內(nèi)皮細(xì)胞表面脫落成為sEPCR進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[11～13]。目前，血漿中sEPCR的水平已被用來(lái)反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的生物標(biāo)志物[14,15]。

參附注射液源自明代著名醫(yī)學(xué)家薛己(薛立齋)編撰的《校注婦人良方》中的參附湯，其由人參一兩、附子五錢(qián)組成。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有益氣、溫陽(yáng)、固脫之功效，主治厥脫及陽(yáng)虛諸證。現(xiàn)代臨床上，主要用于急性心力衰竭、心源性猝死以及休克等疾病[16,17]。這些疾病在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的理論體系中屬于心腎陽(yáng)虛、陽(yáng)氣欲脫、脈細(xì)欲絕以及病勢(shì)危急等證。利用現(xiàn)代藥物學(xué)技術(shù)將其改制為注射液之后，其發(fā)揮臨床療效的速度更加迅速?，F(xiàn)代藥理學(xué)的研究結(jié)果顯示，參附注射液可以減少血管間黏附分子-1(ICAM-1)、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；抑制黃嘌呤氧化酶，抑制氧自由基對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，抑制失血性休克缺血-再灌注時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)氧化；能抑制Caspase-3表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[18～20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組腎組織的EPCR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示創(chuàng)傷對(duì)于腎臟組織EPCR的表達(dá)具有一定的誘導(dǎo)升高的作用，可能與創(chuàng)傷導(dǎo)致的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。但是，因?yàn)楸狙芯康募偈中g(shù)組的創(chuàng)傷較輕微(僅僅暴露了左股動(dòng)靜脈)，其程度不足以導(dǎo)致假手術(shù)組腎組織的EPCR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的程度。失血性休克組與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比明顯升高，提示除了創(chuàng)傷因素導(dǎo)致腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷外，因?yàn)槎虝r(shí)間內(nèi)大量失血導(dǎo)致的休克參與誘導(dǎo)腎臟組織EPCR的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的增加。其原因可能與體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞因子的共同作用效應(yīng)有關(guān)。經(jīng)液體復(fù)蘇后，林格液組及參附注射液組腎臟組織中的EPCRmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均明顯下降，與失血性休克組相比較，具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示失血性休克早期經(jīng)過(guò)充分的液體復(fù)蘇，血液得到了補(bǔ)充，無(wú)論是林格液還是參附注射液都可以改善機(jī)體的微循環(huán)，保護(hù)腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外，參附注射液組的EPCR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平更低，提示其抗凝和抗炎活性較高，與林格液相比較，能夠更加有效地保護(hù)腎小管血管內(nèi)皮細(xì)胞。

另外，與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組腎組織大鼠血清血清尿素氮和肌酐的水平升高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示創(chuàng)傷對(duì)于腎臟功能具有一定的影響。失血性休克組與空白對(duì)照組和假手術(shù)組相比明顯升高，提示除了創(chuàng)傷因素導(dǎo)致腎功能障礙之外，因?yàn)槎虝r(shí)間內(nèi)大量失血導(dǎo)致腎臟缺氧和血流低灌注，嚴(yán)重影響了大鼠的腎功能。經(jīng)液體復(fù)蘇后，林格液組及參附注射液組大鼠血清血清尿素氮和肌酐的水平明顯下降，與失血性休克組相比較，具差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示失血性休克早期經(jīng)過(guò)充分的液體復(fù)蘇，血液得到了補(bǔ)充，糾正了腎臟缺氧和血流低灌注，從一定程度上恢復(fù)了腎臟的正常功能。

空白對(duì)照組與假手術(shù)組的腎小管形態(tài)基本正常。失血性休克組可見(jiàn)大量的腎小管上皮細(xì)胞損傷。損傷評(píng)分明顯高于空白對(duì)照組與假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過(guò)林格液和參附注射液復(fù)蘇后，腎臟組織損傷明顯減輕。這從形態(tài)學(xué)的角度再次證實(shí)了參附注射液可以保護(hù)失血性休克大鼠的腎功能。

綜上所述，失血性休克大鼠的血清尿素氮和肌酐水平，以及腎臟組織EPCR表達(dá)增加，這與失血性休克時(shí)急性腎臟損傷有關(guān)。參附注射液可以抑制腎組織EPCR的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟功能的作用。

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上海市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目，(編號(hào)：ZK2015A19)

王毅鑫

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10.3969/j.issn.1006-6233.2017.07.031