王曉利, 王曉成, 徐曉明, 杜建文, 姜 浩
(河北省承德市中心醫(yī)院, 河北 承德 067000)
聯(lián)合應(yīng)用重組人血管內(nèi)皮抑素與紫杉醇對乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3誘導(dǎo)凋亡作用研究
王曉利, 王曉成, 徐曉明, 杜建文, 姜 浩
(河北省承德市中心醫(yī)院, 河北 承德 067000)
目的:觀察重組人血管內(nèi)皮抑素(恩度)與紫杉醇聯(lián)合用藥作用于乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3后的生長情況及凋亡率。方法:光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況,流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的凋亡率,Realtime PCR法觀察凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)。比較不同給藥方案對乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果:恩度1μg/mL作用48h后的細(xì)胞凋亡率為11.6%(P<0.05),Bcl-2表達(dá)下調(diào),而Bax表達(dá)無明顯改變。紫杉醇1μg/mL作用24h后的細(xì)胞凋亡率為12.4%(P<0.05),Bcl-2表達(dá)下調(diào),而Bax表達(dá)則相對升高。紫杉醇與恩度分別先后序貫給藥,凋亡率分別為16.50%和14.18%(P<0.05),且能夠使Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax表達(dá)升高。二者聯(lián)合且同時給藥后SK-BR-3細(xì)胞的凋亡率為22.74%,明顯高于其他給藥組(P<0.05),同時對Bcl-2表達(dá)下調(diào)明顯且Bax表達(dá)升高。結(jié)論:恩度與紫杉醇均可抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的生長,且對細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用。二者同時給藥產(chǎn)生的效果最佳。
恩 度; 紫杉醇; 乳腺癌; SK-BR-3細(xì)胞; 凋 亡
乳腺癌發(fā)病率逐年攀升,數(shù)據(jù)顯示其在女性腫瘤中占比超過3/10,直接威脅女性健康,但隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步,在當(dāng)前醫(yī)療手段的治療下該類患者的生存率也逐年攀升,但也有少部分患者對化療藥不敏感甚至耐藥,死亡概率高[1]。恩度作為一類新型化療藥物其本質(zhì)是血管生成過程中的抑制劑,通過阻斷血管血供,切斷其營養(yǎng)供應(yīng)路徑,抑制腫瘤血管的新生,進(jìn)而實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤增殖等腫瘤擴(kuò)散或生長環(huán)節(jié)的抑制。且恩度對其他腫瘤細(xì)胞的抵制作用已經(jīng)得到實驗證實[2,3],諸如肝癌、白血病中的HepG2細(xì)胞和HL-60細(xì)胞等。恩度也可抑制腫瘤上清液誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡[4]。本實驗以恩度、紫杉醇、恩度與紫杉醇聯(lián)合,作用于乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞,觀察細(xì)胞生長狀況,檢測細(xì)胞凋亡率,比較各給藥方案對該乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡的影響,并就其具體凋亡機(jī)制做出簡要說明,以更好的指導(dǎo)乳腺癌患者的治療。
1.1 主要試劑與儀器:恩度來源于先聲麥得津生物制藥(山東)批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字S2005008;紫杉醇購于江蘇揚(yáng)子江醫(yī)藥股份,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20059962。Annexin V-FITC相關(guān)的凋亡試劑盒來源于中杉金橋生物公司(北京);細(xì)胞凋亡試劑盒購于美國BD公司;Realtime PCR試劑盒購于Takala公司;一抗Bcl-2、Bax購于Bioworld公司;流式細(xì)胞儀來自河北醫(yī)科大學(xué)分子生物實驗室。
1.2 細(xì)胞來源:人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室提供;RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所產(chǎn)品;胰蛋白酶購自Sigma公司;SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
1.3 乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞的處理:乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3(培養(yǎng)在10%胎牛血清即RPMI-1640),培養(yǎng)箱(5%CO2)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時長依次設(shè)定為37℃和24h。取出培養(yǎng)皿,棄上清液,用PBS液沖洗后加入胰酶進(jìn)行細(xì)胞消化,沖洗次數(shù)和胰酶濃度分別為2次和0.125%,隨后加入培養(yǎng)液即RPMI-1640液結(jié)束細(xì)胞消化過程。消化后離心,將細(xì)胞置于專用離心管內(nèi),首次離心轉(zhuǎn)數(shù)和時長分別為1200轉(zhuǎn)和300s,離心后用PBS液再次進(jìn)行細(xì)胞洗滌,之后進(jìn)行二次離心,離心條件同前。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于下述實驗。制定用藥方案(以預(yù)實驗相關(guān)結(jié)果為參考),共設(shè)定五大用藥方案依次為A方案、B方案、C方案、D方案、E方案,具體如下,A方案為對照組,B方案、C方案為單一化療藥物用藥,B方案為單一紫杉醇用藥,用藥濃度和作用時長分別為1μg/mL和24h,C方案為單一恩度用藥,用藥濃度和作用時長分別為1μg/mL和48h;D方案、E方案、F方案均為紫杉醇、恩度聯(lián)合用藥,其中D方案為紫杉醇先用藥、恩度后用藥,用藥濃度和作用時長參考方案B和方案C;E方案用藥順序與D方案相反、用藥濃度和作用時長同前;F方案則紫杉醇、恩度同時用藥,用藥濃度和作用時長同前。
1.4 光學(xué)顯微鏡下觀察SK-BR-3細(xì)胞的生長情況及藥物作用后該細(xì)胞株的生長:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Realtime PCR法觀察bcl-2、bax的表達(dá)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,顯著性分析主要通過t檢驗進(jìn)行,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 倒置相差顯微鏡下觀察(×200)對照組及各給藥組細(xì)胞的生長情況。細(xì)胞培養(yǎng)滿2d后,SK-BR-3細(xì)胞(A)培養(yǎng)完成,細(xì)胞貼壁,排列緊密,呈鵝卵石樣,培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液需清澈透明,避免渾濁,即方案A;B方案鏡下觀察細(xì)胞貼壁減少、細(xì)胞液清澈度降低,略渾濁,大部分細(xì)胞壞死,細(xì)胞多為類圓形;C方案鏡下觀察細(xì)胞液欠清澈、略渾濁,上層含壞死細(xì)胞,細(xì)胞貼壁較用藥前略增多,但壞死細(xì)胞同樣較多,其排列緊密度較前無明顯變化,細(xì)胞形態(tài)除近圓形外,還可呈現(xiàn)為棱形、梭形;D方案鏡下觀察細(xì)胞液欠清澈較渾濁,上層含大量壞死細(xì)胞,呈團(tuán)絮狀,貼壁細(xì)胞較前減少,大量壞死,細(xì)胞形態(tài)較前無明顯變化,主要呈近圓形。E方案鏡下觀察細(xì)胞液欠清澈較渾濁,上層含大量壞死細(xì)胞,呈絮狀,貼壁細(xì)胞較前減少,大量壞死,細(xì)胞形態(tài)較前無明顯變化,主要呈近圓形;F方案鏡下觀察細(xì)胞液明顯渾濁,上層含大量壞死細(xì)胞,呈團(tuán)絮狀,貼壁細(xì)胞較前明顯減少,大量壞死,殘留細(xì)胞形態(tài)主要呈近圓形(圖1)。序貫用藥過程中須對細(xì)胞進(jìn)行洗滌,洗滌液為不含任何藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液。
圖1 各方案后SK-BR-3細(xì)胞的生長情況
2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各用藥方案作用后SK-BR-3細(xì)胞凋亡率:方案B細(xì)胞凋亡率為12.40%,且隨著作用時間的上調(diào),凋亡率還將隨之上調(diào)。方案C細(xì)胞凋亡率與對照組相比無明顯增加,時間達(dá)72h時細(xì)胞凋亡率11.60%、較前明顯增加。方案D、方案E的細(xì)胞凋亡率分別為16.50%和14.18%。方案F細(xì)胞凋亡率為22.74%,明顯高于其它組(圖2)。比較于對照組,單一紫杉醇治療、單一恩度治療均可導(dǎo)致SK-BR-3細(xì)胞凋亡,二者的凋亡率均具有相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)意義均有統(tǒng)計學(xué)差異,經(jīng)計算P<0.05。單一紫杉醇用藥和紫杉醇、恩度序貫用藥間不具有相應(yīng)統(tǒng)計學(xué)差異,經(jīng)計算P>0.05。紫杉醇先用藥、恩度后用藥與紫杉醇、恩度同時用藥間不具有相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)差異,經(jīng)計算P>0.05,但紫杉醇、恩度同時用藥和恩度先用藥、紫杉醇后用藥間則具有相應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)差異,經(jīng)計算P值<0.05。(表1)。
圖2 流式細(xì)胞儀檢測各給藥方案后SK-BR-3細(xì)胞的凋亡率
在流式細(xì)胞儀相應(yīng)的雙變量散點圖中,左下、右上及右下象限分別對應(yīng)活細(xì)胞、死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞,三者依次對應(yīng)FITC-/PI-、FITC+/PI+和FITC+/PI-。
表1 恩度和/或紫杉醇作用后SK-BR-3細(xì)胞的凋亡率±s)
2.3 Realtime PCR法檢測bcl-2、bax的表達(dá) RT-PCR顯示,與A方案相比較,B方案作用后bcl-2表達(dá)水平下調(diào),P<0.05,bax表達(dá)水平則較A方案上調(diào)明顯,P<0.05;C方案作用后bcl-2表達(dá)水平降低,P<0.05,bax表達(dá)水平則無顯著變化,P>0.05;方案D、方案E均能使bcl-2表達(dá)水平相對降低,P均<0.05,并且bax表達(dá)水平則較A方案上調(diào)較明顯,P均<0.05,但D、E兩組的統(tǒng)計學(xué)差異不明顯,P>0.05;與其它各方案相比,方案F可顯著降低bcl-2的表達(dá)水平,P<0.05,bax表達(dá)水平上調(diào)明顯與A方案比較P值<0.05(圖3)。
圖3 Realtime PCR法檢測各給藥方案作用后SK-BR-3細(xì)胞bcl-2、bax的表達(dá)
臨床前研究結(jié)果顯示恩度在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、腫瘤及血管生成中均具有很好的一致性,臨床I期、臨床Ⅱ期實驗證實,恩度單一治療乳腺癌具有安全性,臨床Ⅲ期實驗證實,聯(lián)合NP方案后,恩度對非小細(xì)胞型肺癌(晚期)具有良好的治療作用,可顯著上調(diào)其生存率且相對安全[5]。趙妍等[6]將恩度作用于Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞,結(jié)果顯示其可抑制細(xì)胞生長,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,將該細(xì)胞系阻滯于G2期。本研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗顯示恩度可抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞生長。
紫杉醇以微管為靶點,作用于特異性的細(xì)胞周期,可有效阻斷M期、G2期,可促進(jìn)微管聚合,保持微管的穩(wěn)定,抑制微管功能及紡錘體形成,阻斷腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,終止腫瘤細(xì)胞生長過程。體外實驗已顯示紫杉醇對小鼠L1210、P388和P1534白血病、B16黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞有抗腫瘤活性[7]。本研究細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗顯示紫杉醇也可抑制乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞生長。凋亡實驗顯示二者單藥均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05)。同時給藥細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05),其與先紫杉醇后恩度組所產(chǎn)生的凋亡影響差異不顯(P>0.05),而與先恩度后紫杉醇組相比較有明顯差異(P<0.05)。這可提示臨床應(yīng)用中首選二者同時給藥,次選先紫杉醇后恩度給藥。
抗凋亡蛋白之bcl-2,及bax促凋亡蛋白分別對細(xì)胞凋亡起正性調(diào)節(jié)和負(fù)性調(diào)節(jié)作用。bcl-2/bax比值高低直接影響著細(xì)胞是否凋亡,數(shù)值降低則細(xì)胞凋亡,數(shù)值升高則細(xì)胞凋亡受阻[8]。據(jù)報道,恩度抑制多種腫瘤細(xì)胞生長、可對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡程序誘導(dǎo),相關(guān)作用機(jī)制可能與恩度相關(guān)的bcl-2表達(dá)水平改變有關(guān)[9,10]。根據(jù)本研究,我們發(fā)現(xiàn),恩度和紫杉醇均可促進(jìn)鈣蛋白表達(dá)水平降低,但二者均不能影響bax蛋白表達(dá)。與單一紫杉醇用藥相比,紫杉醇+恩度用藥尤其是二者同時用藥可使bcl-2表達(dá)水平顯著下調(diào),這在一定程度上與二者聯(lián)合用藥,臨床療效相對增強(qiáng)相吻合。先紫杉醇后恩度組和先恩度后紫杉醇組的細(xì)胞凋亡率差異不明顯(P>0.05),表明序貫給藥前后順序及作用時間對凋亡影響不大。結(jié)合圖2顯示,同時給藥組作用后活細(xì)胞數(shù)目最少,也顯示出同時給藥在直接殺傷腫瘤細(xì)胞同時,還可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長。
Her-2細(xì)胞相關(guān)實驗證實[6]恩度可顯著下調(diào)該類乳腺癌細(xì)胞的表達(dá),有效作用于細(xì)胞分裂周期G2期,阻斷腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其走向凋亡。而紫杉醇在細(xì)胞分裂的G2/M期發(fā)揮作用,這一結(jié)果也可能對二者協(xié)同增效作用作出解釋。未來,我們尚需檢測各給藥方案作用后細(xì)胞周期的變化,從而進(jìn)一步了解二者增效機(jī)制,更好地指導(dǎo)臨床用藥。
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Apoptosis Induced by Recombinant Human Endostatin and Paclitaxel in Breast Cancer Cell Line SK-BR-3
WANGXiaoli,WANGXiaocheng,XUXiaoming,etal
(ChengdeCentralHospital,HebeiChengde067000,China)
Objective:To observe the growth and apoptosis rate of recombinant human endostatin combined with paclitaxel in breast cancer cell line SK-BR-3. Methods: The growth of cells was observed under light microscope. The apoptosis rate of breast cancer cell SK-BR-3 was detected by flow cytometry. The expression of apoptosis related protein Bcl-2/Bax was observed by Realtime PCR method. The apoptosis inducing effects of different administration protocols on breast cancer cell line SK-BR-3 were compared. Results: Apoptosis of Endostar 1 g/ml after 48h was 11.6% (P<0.05), Bcl-2 expression, and the expression of Bax was not changed. The rate of apoptosis was 12.4% (P<0.05) after paclitaxel was 1 g/ml, and the expression of Bcl-2 was down regulated, while the expression of Bax was increased by 24h. Paclitaxel and sequential administration of Endostar respectively, the apoptosis rates were 16.50% and 14.18% (P<0.05), and can down regulate the expression of Bcl-2, increase the expression of Bax. The apoptosis rate of SK-BR-3 cells was 22.74%, which was significantly higher than that of other administration group (P<0.05), and the expression of Bcl-2 was down regulated and the expression of Bax was elevated at the same time when the two groups were combined and administered at the same time. Conclusion: Both endostar and paclitaxel can inhibit the growth of breast cancer cell line SK-BR-3 and induce apoptosis. The two drugs simultaneously produced the best effect.
Endostar; Paclitaxel; Breast cancer; SK-BR-3 cells; Apoptosis
1006-6233(2017)07-1091-04
河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題,(編號:20160306)
姜 浩
A
10.3969/j.issn.1006-6233.2017.07.011